抗ALV-J MF59/TLR7/8-Agonist佐剂重组Gp85蛋白疫苗的研制及对鸡的免疫效果研究

摘要

J亚群禽白血病病毒(Subgroup J Avian leukosis Virus，ALV-J)是上世纪90年代从肉用型鸡群中分离的一种由反转录病毒引起的高度传染性的新型禽白血病病毒，主要引起骨髓细胞瘤。1999年我国首次从白羽肉鸡中分离出该病毒。目前已出现大量在我国地方品系鸡群以及蛋鸡中关于ALV-J感染的报道。ALV-J的广泛传播，已给我国养禽业造成了不可估量的潜在风险和经济损失。为控制和预防ALV-J的流行，保护优良地方品系鸡，国家开始对地方种鸡实施种群净化的战略决策。但由于我国种鸡品系和种群数量大、饲养不规范和饲养密集等特点，需要继续加强对ALV-J的研究，并探索更有效的防治措施以降低各鸡群的ALV-J感染率和发病率。疫苗预防对于动物性传染病的控制，一直是一种行之有效的方法，但针对ALV-J，至今仍无有效的疫苗可在生产中加以应用。因此，ALV-J疫苗的研制显得尤为迫切。
　　本研究根据已发表的ALV-J囊膜蛋白gp85基因序列，设计一对特异性引物。从分离自我国肉鸡样品的ALV-JNX0101毒株cDNA中扩增得到目的基因，并通过PCR及测序鉴定。将gp85目的基因连接至Pet28a原核表达载体，并将鉴定确实的重组表达载体Pet28a-gp85转化入E.coli Rosetta(DE3)菌株，IPTG适温诱导后大量收获稳定表达的菌体蛋白，并对包涵体蛋白进行Ni柱纯化。使用ALV-J单克隆抗体，通过蛋白印迹(Western-blot)方法对重组表达蛋白进行特异性验证。将纯化重组蛋白与不同佐剂（MF59佐剂，R848佐剂和弗氏佐剂）通过超声进行乳化，制备多种ALV-J重组蛋白佐剂疫苗。疫苗中重组gp85蛋白含量为600μg/dose。根据免疫佐剂种类的不同，将96只海兰褐雏鸡随机分为八组，即空白对照组、gp85-PBS组、gp85-PBS对照组、gp85-MF59组、gp85-雷西莫特组、gp85-弗氏佐剂组、gp85-MF59+雷西莫特组和gp85-弗氏佐剂+雷西莫特组。别于14和21日龄，通过腿部肌肉注射对鸡群进行免疫和一次加强免疫。每周通过ELISA（酶联免疫吸附试验，Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay）检测血清中ALV-J抗体IgG水平，加强免疫后进行攻毒试验。通过病毒血症的检测，评价佐剂重组蛋白疫苗的免疫保护效果。
　　结果显示:除对照组外，各实验组均可诱导产生一定水平的阳性抗体(S/P＞0.6);二次免疫可以增强免疫效果，使阳性抗体水平进一步提高，维持时间进一步延长;与只免疫gp85蛋白组相比，含佐剂疫苗诱导的抗体反应更加强烈，特别是在早期诱导强度和抗体反应持续时间上较显著。MF59佐剂疫苗诱导的抗体水平（急剧增加，并保持时间最长）最高。更重要的是，结果表明免疫记忆可以被MF59/R848佐剂疫苗更迅速地调动起来。且免疫后三个月内，高滴度的抗体水平仍可以在MF59/R848免疫组中被检测到。
　　通过腹腔注射方法，将1mL102.4 TCID50 NX0101株ALV-J细胞上清液接种于上述各试验组鸡只（空白对照组随机挑取一半数量），于5周龄进行攻毒，每7天无菌采集一次血浆进行病毒血症的检测。结果显示:各组的保护率分别为gp85+PBS组为16.7％;gp85+MF59+R848佐剂组和gp85+弗氏佐剂组为50％;gp85+MF59佐剂组为66.7％;gp85+R848佐剂组为83.3％。这些结果表明，R848佐剂疫苗免疫保护作用最强。同时，通过与偏于激活TH2型免疫途径的MF59佐剂的效果进行比较，R848作为TH1型免疫调节剂具有更好地保护力，推测外泌体或其他信号物质的存在及其作用，可能对肿瘤疾病防控与治疗的进一步研究具有重大意义。
　　本研究为MF59/R848佐剂包被ALV-J gp85蛋白疫苗应用于临床预防ALV-J提供了有力的实验依据，对我国将来实现ALV-J的净化具有重要的意义。

目录

声明

论文说明

英文缩略词表

摘要

1 前言

1．1 J亚群禽白血病病毒概述

1．1．1 ALV-J的一般生物学特性

1．1．2 ALV-J的分子生物学特征

1．1．3 ALV-J的诊断检测及研究现状

1．2 疫苗佐剂概述

1．2．1 MF59佐剂研究进展

1．2．2 R848研究进展

1．2．3 MF59与R848的制备方法

1．3 本研究目的意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 主要实验仪器

2．1．2 实验材料

2．1．3 实验动物

2．1．4 培养基的配制

2．1．5 其他实验相关溶液的配制

2．2 方法

2．2．1 重组表达载体Pet28a-gp85的构建

2．2．2 ALV-J gp85蛋白的制备与验证

2．2．3 ALV-J gp85蛋白佐剂疫苗的制备

2．2．4 佐剂疫苗免疫效果研究

2．3 数据处理

3 结果与分析

3．1 重组表达载体Pet28a-gp85的鉴定

3．2 gp85蛋白的制备

3．2．1 gp85蛋白的诱导表达、纯化及免疫原性分析结果

3．2．2 蛋白浓度的测定结果

3．3 重组gp85蛋白MF59／R848佐剂疫苗的制备

3．3．1 MF59／R848佐剂疫苗稳定性的测定结果

3．3．2 MF59／R848佐剂疫苗安全性的检验结果

3．4 ALV-J gp85重组蛋白与免疫佐剂联合接种诱导免疫保护的研究

3．4．1 血清中ALV-J特异性抗体的检测

3．4．2 病毒血症的检测

4 讨论

4．1 J亚群禽白血病病毒的流行现状

4．2 重组gp85蛋白MF59／R848佐剂疫苗的质量检验

4．3 重组gp85蛋白MF59／R848佐剂疫苗免疫效果

4．4 两种佐剂疫苗效果对比研究

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况及著作