脂质体包被ALV-J gp85蛋白疫苗制备及其免疫效果研究

摘要

J亚群禽白血病病毒(Subgroup J Avian leukosis Virus，ALV-J)是上世纪90年代从肉用型鸡群中分离的一种新型禽白血病病毒，主要引起骨髓细胞瘤。1999年中国首次从白羽肉鸡中分离到ALV-J，近年来研究表明ALV-J已传播到我国不同地区的地方品系鸡及蛋用型鸡群中，给我国养鸡业造成严重的经济损失。
　　本课题旨在通过脂质体包被ALV-J gp85蛋白疫苗制备及其免疫效果研究，为临床应用脂质体蛋白疫苗预防ALV-J的科学前景提供有力的实验依据。
　　采用原核诱导表达方法制备重组gp85蛋白:首先将gp85基因重组于表达载体PET-28a，然后将构建好的重组载体PET-28a-gp85转化入Rosetta(DE3)菌株，以0.5mMIPTG于37℃诱导6h后收获菌体蛋白，并对包涵体蛋白通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western-blot)方法进行验证，最后对gp85蛋白进行纯化及浓度的测定。蛋白浓度测定结果为2mg/mL。
　　采用逆相蒸发法制备gp85蛋白脂质体疫苗，并应用鱼精蛋白法检测其包封率。结果显示:卵磷脂/胆固醇（摩尔比）为1∶1，重组gp85蛋白液浓度为2mg/mL，吐温-80为3mL，有机相/水相（体积比）为3:1，鱼精蛋白法检测包封率为40％。
　　通过腿部肌肉注射方法，将重组gp85蛋白联合弗氏佐剂及gp85蛋白脂质体分别免疫接种于鸡群，每7d采集一次血液并检测血清中抗体水平。根据免疫次数及佐剂种类的不同，将60只海兰褐雏鸡随机分为五组，即空白对照组、弗氏佐剂组（免疫一次）、弗氏佐剂组（免疫二次）、脂质体组（免疫一次）和脂质体组（免疫二次）。其中，一免于1周龄进行，二免于3周龄进行。采用酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)方法进行抗体检测，结果表明:除对照组外，各实验组均可诱导产生一定水平的阳性抗体(S/P＞0.6);二次免疫可以增强免疫效果，使阳性抗体水平进一步提高，维持时间进一步延长;弗氏佐剂组中阳性抗体产生迅速，抗体高峰出现时间较早;脂质体组中阳性抗体产生较缓慢，但高抗体水平维持时间较长。
　　通过腹腔注射方法，将1 mL102.4半数组织培养感染量(50％ tissue culture infectivedose，TCID50)NX0101株ALV-J细胞上清液接种于上述各试验组鸡只（空白对照组随机挑取一半数量），于5周龄进行攻毒，每7天无菌采集一次血浆进行病毒血症的检测，连续进行3周。结果显示:各实验组间比较，脂质体组比弗氏佐剂组免疫保护率高;各实验组内3周内表现出不同的免疫保护率，可能与病毒感染过程及机体抗体水平有关;第2周时各实验组抗体水平及病毒血症检测结果分析表明血清中抗体水平的高低将直接影响免疫保护率。
　　本研究为脂质体包被ALV-J gp85蛋白疫苗应用于临床预防ALV-J提供了有力的实验依据，对我国将来实现ALV-J的净化具有重要的意义。