检测两型鸭圆环病毒双重PCR方法的建立和分子流行病学调查

摘要

鸭圆环病毒(Duck circovirus，DuCV)属于圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)，基因组为单股共价闭合环状DNA，整个基因组大小约为2kb。鸭圆环病毒主要侵害病鸭的胸腺、法氏囊等免疫器官。鸭感染DuCV后表现为生长发育障碍、生长停滞，在出壳几周内发病，生长停滞和羽毛形状失常。近年来实验室建立了检测鸭圆环病毒的PCR方法和ELISA方法，但至今没有快速对鸭圆环病毒的分型检测方法。本实验利用两型鸭圆环病毒Cap蛋白基因序列的特异性对两型鸭圆环病毒分型。
　　本研究主要进行了如下工作:
　　1.检测两种基因型鸭圆环病毒双重PCR方法的建立
　　DuCV存在两个基因型，两型DuCV的Cap基因核酸序列同源性在78％左右，二者之间的Cap蛋白序列的同源性只有77.6％左右，抗原表位预测分析表明二者之间也存在较大差异。而根据DuCV基因组同源性分型结果和Cap蛋白序列的分型结果基本一致，因此，我们选择Cap蛋白对DuCV进行分型鉴定。通过对从Genbank上下载的56个DuCV序列进行同源性分析，结合两个基因型DuCV Cap基因比对结果，设计了四条特异性引物，并对PCR反应条件进行了优化，建立了双重PCR检测方法。研究结果表明，该方法特异性强，能够对两型DuCV进行分型检测，且不受组织DNA和其他病原的影响;灵敏度高，最多能够检测到10个拷贝的鸭圆环病毒DNA，能够用于DuCV的分型检测和分子流行病学调查。
　　2.利用双重PCR方法对山东地区养鸭场进行流行病学检测
　　我们在不同时间采集了潍坊地区的8个鸭群共120只（每个鸭群15只）龄病死弱雏，采集其肝脏、胸腺、脾脏、法氏囊、肾脏、心脏等器官进行DuCV检测。使用建立的双重PCR检测方法进行分子流行病学检测，检测结果表明:3个鸭群(37.5％)检出DuCV-1和DuCV-2的混合感染，3个鸭群(37.5％)检出DuCV-2的单独感染。15只雏鸭被检出感染DuCV，其中3.33％(4/120)的雏鸭检出DuCV-1和DuCV-2的混合感染，9.17％(11/120)的雏鸭只感染DuCV-1或DuCV-2。采集泰安地区8个鸭群共120只雏鸭（每个鸭群15只）以同样的方法进行流行病学检测，没有检出DuCV感染。试验结果表明山东省老养殖区鸭群中存在较为严重的DuCV-1和DuCV-2混合感染的现象。
　　3.对鸭圆环病毒是否垂直传播的初步探究
　　王鑫等于2012年对潍坊地区鸭场进行DuCV检测，发现鸭场DuCV-1阳性率为27.32％，DuCV-2阳性率为42.81％。我们对DuCV感染阳性的某种鸭场中进行了跟踪检测，共收集了80枚未孵化的种蛋、30只孵化过程中出现的死胚和120只刚出壳的雏鸭作为检测对象，用本研究建立的多重PCR检测方法进行分子流行病学检测。种蛋中DuCV-2单独感染阳性率为2.50％，两型DuCV混合感染率为1.25％，没有检测到DuCV-1单独感染;死胚中DuCV-1单独感染率为3.33％，DuCV-2单独感染率为6.67％，两型DuCV混合感染率为3.33％;刚出壳雏鸭中DuCV-1单独感染率为2.50％，DuCV-2单独感染率为6.67％，两型DuCV混合感染率为3.33％。试验结果表明，该鸭场种蛋存在DuCV的感染，这也为DuCV的垂直传播提供了直接证据。

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符号及缩略词

摘要

1 文献综述

1.1 圆环病毒科

1.2 鸭圆环病毒的研究进展

1.2.1 鸭圆环病毒的病原学特征

1.2.2 鸭圆环病毒的分类地位

1.2.3 鸭圆环病毒的基因组结构

1.2.4 鸭圆环病毒部分蛋白生物活性的研究进展

1.3 鸭圆环病毒的流行病学

1.3.1 鸭圆环病毒感染的流行情况

1.3.2 鸭圆环病毒的危害

1.3.3 鸭圆环病毒的诊断

1.4 PCR技术在DuCV检测中的应用

1.4.1 常规PCR方法

1.4.2 多重PCR方法

1.4.3 荧光定量PCR技术

1.4.4 套式PCR

1.4.5 等温环介导PCR

1.4.6 套式PCR

1.5 本研究的目的意义

2.材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌种

2.1.2 仪器和设备

2.1.3 相关溶液的配制

2.2 方法

2.2.1 检测两型DuCV双重PCR方法的建立

2.2.2 山东部分地区DuCV分子流行病学调查

2.2.3 对DuCV是否垂直传播的初步探究

3 结果与分析

3.1 检测两型鸭圆环病毒双重PCR方法的建立

3.1.1 引物设计结果

3.1.2 引物特异性初步鉴定结果

3.1.3 探索最佳反应条件结果

3.1.4 双重PCR特异性检测结果

3.1.5 双重PCR灵敏性检测结果

3.2 山东地区部分鸭场的分子流行病学调查

3.3 对DuCV是否垂直传播的初步探究

4 讨论

4.1 DuCV分子流行病学调查

4.2 山东地区部分养鸭场DuCV的分子流行病学调查

4.3 种蛋和孵化过程中的死胚DuCV的PCR检测

5 结论

参考文献

致谢

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