C型产气荚膜梭菌类霉素疫苗与抗毒素血清的制备研究

摘要

为制备具有高效保护力的C型产气荚膜梭菌类毒素疫苗，利用C型产气荚膜梭菌标准菌株(NCTC3180)所产外毒素经甲醛灭活并加入佐剂乳化后，制备了C型产气荚膜梭菌类毒素疫苗;将该疫苗免疫母猪后检测母猪初乳和仔猪血清的抗体效价;用制备的C型产气荚膜梭菌类毒素疫苗分别多次免疫猪，隔段时间后采集血液，制备血清，测定血清中的抗毒素效价。
　　本研究分为3部分进行:
　　第一部分:C型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备。对C型产气荚膜梭菌标准菌种(NCTC3180)进行复苏、增菌、产毒，再用0.22μm滤器过滤除去菌体得到毒素溶液，然后用甲醛对毒素进行灭活后，分别加入白油佐剂和氢氧化铝胶佐剂制得两种C型产气荚膜梭菌类毒素疫苗。
　　第二部分:类毒素疫苗的检验。参照《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》分别对疫苗进行了安全性检验，无菌检验，免疫效力检验。分别在分娩前30和15天免疫接种怀孕母猪，通过间接ELISA和毒素中和试验评估母猪初乳和14日龄仔猪血液中抗体效价水平。结果显示，母猪初乳和仔猪血清中抗毒素效价分别为1∶3200，1∶1600，母猪初乳和仔猪血液中的中和效价均为1∶6。表明制备的类毒素疫苗效价高并安全可靠，免疫实验动物后能对仔猪起到一定的保护作用。
　　第三部分:抗毒素血清的制备。采用制备的C型产气荚膜梭菌白油佐剂类毒素疫苗多次免疫猪，采集血液，制备血清，参照《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》分别对血清进行了安全性检验和无菌检验;通过间接ELISA法和小鼠的血清中和试验测定血清效价。结果显示:血清的安全性检验和无菌检验均符合标准;间接ELISA法测定猪血清中的抗α抗体效价为1∶6400;间接ELISA法测定猪血清中的抗β抗体效价为1∶12800。0.1mL的C型产气荚膜梭菌高免血清可以中和500个MLD。

目录

声明

论文说明

符号说明

摘要

1．引言

1．1．产气荚膜梭菌概述

1．2．产气荚膜梭菌致病性

1．3．产气荚膜梭菌病在国内外流行状况

1．5．产气荚膜梭菌致病机理及防控措施

1．6．研究的目的及意义

2．材料

2．1．菌种与培养基

2．1．1．产气荚膜梭菌菌种

2．1．2．5％绵羊血平板

2．1．3．产毒培养基——Gordon汤

2．1．4．硫乙醇酸盐流体培养基

2．1．5．硫乙醇酸盐培养基(T．G)

2．1．6．葡萄糖蛋白胨培养基(G．P)

2．1．7．酪素胰酶消化液(G．A)

2．2．实验动物

2．3．主要仪器

2．4．试剂的配制

3．方法

3．1．1．C型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备

3．1．2． 菌种复苏

3．1．3． 硫乙醇酸盐流体培养基中增菌

3．1．4．C型产气荚膜梭菌外毒素的制备

3．1．5．C型产气荚膜梭菌外毒素的检测

3．1．6．β毒素的提纯

3．1．7．C型产气荚膜梭菌类毒素疫苗制备

3．2．疫苗的初步检查

3．2．1．白油佐剂类毒素疫苗的物理性状检验

3．2．2．两种类毒素疫苗的无菌检验

3．2．3．两种疫苗的甲醛、硫柳汞残留量的检验

3．2．4．安全性检验

3．2．5．外毒素对兔子致死量的确定

3．2．6．免疫效力试验

3．2．7．两种疫苗对家兔免疫效果的比较

3．2．8．动物试验

3．3．C型产气荚膜梭菌抗毒素血清的制备

3．3．1．免疫试验动物

3．3．2．α毒素的提纯

4．结果

4．1．外毒素制备

4．1．1．菌种复苏

4．1．2．硫乙醇酸盐流体培养基中增菌

4．2．外毒素检测

4．2．1．C型产气荚膜梭菌外毒素活性测定

4．2．2．聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测毒素蛋白

4．2．3．Enterotoxaemia ELISA kit检测毒素抗原

4．3．α和β毒素的精提

4．3．1．采用SephadexG-25对粗提的C型产气荚膜梭菌外毒素除盐

4．3．2．采用SephadexG-200对浓缩液提纯

4．3．3．聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果

4．3．4．采用SephadexG-25对粗提的A型产气荚膜梭菌外毒素除盐

4．3．5．聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果

4．4．外毒素的灭活

4．5．C型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的检验

4．5．1．C型产气荚膜梭菌白油佐剂类毒素疫苗的物理性状检验

4．5．2．C型产气荚膜梭菌白油佐剂类毒素疫苗的粘度检验

4．5．3．类毒素疫苗的无菌检验和甲醛、硫柳汞残留量检验

4．5．4．安全性检验

4．5．5．外毒素对兔子致死量的确定

4．5．6．免疫效力试验

4．5．7．两种疫苗对家兔保护效果的比较

4．6．动物试验

4．6．1．间接ELISA测定初乳和血清中的抗体效价

4．6．2．毒素中和试验

4．7．血清效价检验

4．7．1．间接ELISA法测定猪血清中的抗α、β毒素抗体效价

4．7．2．小鼠的血清中和试验

4．8．C型产气荚膜梭菌抗毒素血清检验

5．讨论

5．1．制备C型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的意义

5．2．C型产气荚膜梭菌外毒素制备过程中培养基的选择

5．3．外毒素的灭活

5．4．佐剂的选择

5．5．疫苗的保护性试验研究

5．6．α和β毒素的提纯

5．7．C型产气荚膜梭菌抗毒素血清的研究

6．结论

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表论文情况