E型产气荚膜梭菌类毒素疫苗与抗毒素血清的研制

摘要

产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens，C. perfringens），旧称魏氏梭菌（Clostridium welchii）属于梭菌芽孢杆菌属的成员，可形成芽孢，繁殖速度快并分泌外毒素。根据4种主要外毒素（alpha、beta、epsilon和iota毒素），产气荚膜梭菌分为了5个毒素型即A、B、C、D和E型产气荚膜梭菌。动物的发病或死亡取决于产气荚膜梭菌分泌的外毒素。E型产气荚膜梭菌主要分泌alpha毒素和iota毒素，主要要引起犊牛和羔羊的痢疾，造成犊牛和羔羊的肠道不同程度的损伤，影响动物的营养的吸收，甚至于动物死亡。为了认识、预防和治疗E型产气荚膜梭菌疾病，本研究分为三部分进行。 第一部分：E型产气荚膜梭菌外毒素致病性的研究。为了解E型产气荚膜梭菌外毒素的致病性，本部分实验测定了E型产气荚膜梭菌的外毒素对昆明鼠的LD50以及肠道和肝脏的病理变化。通过E型产气荚膜梭菌菌种的复苏、增殖和大量分泌外毒素等过程，制备出了E型产气荚膜梭菌外毒素。外毒素经过Sephadex G-25和透析袋的除盐及浓缩，获得了精提的外毒素。同时，通过建立牛血清白蛋白的标准曲线及方程式，本试验测量了精提的外毒素的浓度为1.2 mg/mL。将精提的外毒素进行2倍倍比稀释，选择的不同浓度梯度，腹腔注射精提的外毒素攻毒昆明鼠，记录死亡率，通过Reed-Muench方法，计算LD50。结果显示，昆明鼠的LD50为2.84 mg/kg。为了更深入的理解E型产气荚膜梭菌外毒素的对动物肠道和肝脏的损害情况，本实验以昆明鼠为动物模型，采取攻毒死亡的昆明鼠的空肠、结肠、肝脏等组织，进行石蜡切片和HE染色。结果显示，相对于对照组，试验中的昆明鼠的肠道和肝脏出现了严重的损伤。 第二部分：E型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备。为了预防E型产气荚膜梭菌产生的危害，本部分实验制备了E型产气荚膜梭菌白油佐剂类毒素疫苗和氢氧化铝胶类毒素疫苗。首先摸索E型产气荚膜梭菌外毒素的灭活条件为37℃、0.3% 甲醛，灭活24 h。并加入两种佐剂制备了E型产气荚膜梭菌类毒素疫苗。根据参照《中华人民共和国兽用生物制品质量标准 》分别对疫苗进行了物理性状检验、安全性检验和无菌检验。将制备的白油佐剂和氢氧化铝胶类毒素疫苗接种新西兰兔，并通过ELISA方法，测定新西兰兔血清抗体消长规律，结果显示，白油佐剂的类毒素疫苗在第5周达到最高，抗体滴度达1：3200，并且抗体水平维持18周；氢氧化铝类毒素疫苗免疫新西兰兔血清抗体水平在第3周达到最高，血清抗体滴度为1：1600，维持时间仅仅一周。进一步，通过攻毒保护实验，检测了白油佐剂类毒素疫苗对昆明鼠的保护效果。结果显示，通过皮下接种0.2 mL的白油佐剂类毒素疫苗于昆明鼠后的第4周，可以完全保护昆明鼠。证明白油佐剂类毒素疫苗具有可靠的免疫保护效果，可以应用于生产。 第三部分：E型产气荚膜梭菌抗毒素血清的制备。为了能够进行紧急免疫或治疗患有E型产气荚膜梭菌疾病的动物，在类毒素疫苗研制的基础上，进行了E型产气荚膜梭菌抗毒素血清的制备。将制备的E型产气荚膜梭菌白油佐剂类毒素疫苗按照免疫程序强化皮下接种绵羊，并最终成功制备了高免血清。通过中和实验测定该高免血清可以中和50个MLD。国内首次制备这种高免血清，为E型产气荚膜梭菌感染的紧急治疗提供保障。

目录

声明

符号说明

1 引言

1.1 产气荚膜梭菌概述

1.2 alpha毒素结构特点及作用机理

1.3 Iota毒素结构特点和作用机理

1.4 肠毒素结构特点和作用机理

1.5 产气荚膜梭菌的致病情况及流行状况

1.6 产气荚膜梭菌疾病的致病机理和防控措施

1.7 抗毒素血清的研究进展

1.8 研究目的及意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

3 结果

3.1 外毒素的制备

3.2 E型产气荚膜梭菌外毒素致病特点

3.3 E型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备

3.4 两种疫苗接种兔的血清抗体动态变化

3.5 白油佐剂类毒素疫苗的免疫效力

3.6 抗毒素血清的检验

3.7血清中和实验

4 讨论

4.1 E型产气荚膜梭菌外毒素的致病性

4.2 E型产气荚膜梭菌外毒素的制备

4.3 E型产气荚膜梭菌外毒素的灭活与类毒素疫苗的制备

4.4 接种家兔的血清抗体水平变化和保护力的检测

4.5 E型产气荚膜梭菌抗毒素血清的制备

5 结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表论文情况

附录