5-羟色胺对奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)增殖凋亡及酪蛋白合成的调控机制

摘要

5-HT被认为是一种反馈性抑制泌乳和诱导乳腺退化的关键因子，但是其对奶牛乳腺上皮细胞增殖凋亡的影响及机制尚不明确。奶牛乳腺表达多种亚型的5-HT受体(HTR1B，2A，2B，4和7)，选择性阻断HTR1B和HTR2A引起乳蛋白表达量升高，但其作用机制目前亦未见报道。本研究以奶牛乳腺上皮细胞（MAC-T细胞系）为模型，明确5-HT对细胞增殖凋亡的影响，初步探明其作用机制，并探寻5-HT调控乳蛋白合成的信号通路。
　　首先对MAC-T细胞进行传代培养及鉴定。观察其形态为“cobblestone”结构，生长曲线呈“S”形，反复传代和冻存，细胞形态、功能稳定并保持旺盛增殖活力，并表达上皮细胞骨架蛋白—角蛋白18。用PRL和INS处理，在mRNA和蛋白水平均检测到酪蛋白的表达。利用RT-PCR技术检测到5-HT合成限速酶TPH1，以及1B、2A、2B、4、7、5A、3A、1F、1D、2C、1E、1A等多种亚型5-HT受体的表达，表明MAC-T细胞为具有分泌活性的奶牛乳腺上皮细胞，能够合成5-HT并表达多种亚型的5-HT受体，适合作为本研究的模型。
　　为明确5-HT对MAC-T细胞增殖与凋亡的影响，本试验用不同浓度5-HT处理MAC-T细胞12h，24h，48h，72h，利用CCK-8试剂盒测定细胞的增殖情况，发现短时间(12h，24h，48h)5-HT处理，促进MAC-T细胞的增殖。而长时间(72h)5-HT处理抑制了MAC-T细胞的增殖。选择性5-HT2B(SB204741)、5-HT2A(Ritanserin)、5-HT4(SB204070)、5-HT7(Pimozide)、5-HT1B(SB224289)受体拮抗剂处理MAC-T细胞24h，测定细胞增殖情况，发现选择性5-HT1B、4受体拮抗剂对5-HT诱导的MAC-T的增殖具有明显的抑制作用。而选择性5-HT2A、2B、7受体拮抗剂对5-HT诱导的MAC-T细胞的增殖无影响。利用200μM5-HT处理细胞72h，20μM5-HT处理细胞24h，RT-qPCR法检测增殖凋亡相关因子caspase3、caspase8、Bax、Bcl-2的相对表达量，发现200μM5-HT处理细胞72h，显着抑制Bcl-2 mRNA表达，显着提高caspase3、caspase8的mRNA表达量，并引起Bax/Bcl-2值升高。而20μM5-HT处理MAC-T24 h，Bax/Bcl-2的值与对照组相比降低，caspase3 mRNA表达量显着降低。这些结果提示5-HT可通过改变Bax/Bcl-2的比值以及caspase3、caspase8的表达量来调控细胞的命运。
　　为探寻5-HT调控酪蛋白合成的信号通路，本试验利用20μM5-HT处理细胞48h，RT-qPCR法测定参与乳蛋白合成调节过程中的关键激酶和调节因子JAK2、STAT5、mTOR、rpS6K1、4EBP1、eIF4E的相对表达量。结果发现，5-HT处理后STAT5的表达显着降低，JAK2有降低的趋势。但4EBP1、eIF4E、eEF2、mTOR、rpS6K1 mRNA的相对表达量均不受影响。这提示JAK2-STAT5信号通路参与5-HT对酪蛋白合成的调控过程。
　　总之，低浓度短时间5-HT处理可以促进MAC-T的增殖，高浓度长时间5-HT处理抑制MAC-T的增殖。5-HT对MAC-T增殖的诱导作用是通过1B、4亚型受体，而非2A、2B和7受体来实现的。5-HT可通过改变caspase3、caspase8表达、Bax/Bcl-2的值来调控细胞的增殖凋亡。JAK2-STAT5信号通路参与5-HT对酪蛋白合成的调控过程。而在MAC-T细胞中，mTOR信号通路不参与5-HT功能的调控。

目录

声明

英文缩略表

摘要

1 前言

1．1 奶牛乳腺发育和泌乳研究进展

1．1．1 奶牛乳腺发育过程

1．1．2 泌乳周期内奶牛乳腺细胞的增殖和凋亡

1．1．3 奶牛乳腺上皮细胞系模型的建立

1．1．4 奶牛乳腺发育及泌乳的调控机制研究

1．2 5-HT对奶牛乳腺发育及泌乳的调控及机制研究进展

1．2．1 乳腺内5-HT的合成与代谢

1．2．2 乳腺内5-HT再摄取

1．2．3 乳腺内5-HT能系统

1．2．4 5-HT对乳腺退化的调控

1．2．5 5-HT对乳产量及乳蛋白合成的调控

1．2．6 5-HT调控泌乳和乳腺退化的机制

1．3 本课题研究目的

2 材料和方法

2．1 试验材料

2．1．1 MAC-T细胞与奶牛乳腺组织

2．1．2 主要仪器与试剂

2．1．3 主要试剂的配置

2．2 试验方法

2．2．1 体外培养奶牛乳腺上皮细胞系(MAC-T)

2．2．2 RT-PCR和荧光定量PCR

2．2．3 Western blot印记分析

2．3 奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)形态功能鉴定及五羟色胺受体的表达

2．4 5-HT对MAC-T细胞增殖和凋亡的影响及其机制初探

2．4．1 5-HT对乳腺上皮细胞增殖的影响

2．4．2 不同亚型的5-HT受体对MAC-T细胞增殖的影响

2．4．3 5-HT对细胞增殖凋亡相关因子表达量的影响

2．5 5-HT对乳蛋白合成关键激酶和调节因子mRNA表达量的影响

2．6 统计分析

3 结果与分析

3．1 奶牛乳腺上皮细胞的形态学鉴定

3．2 MAC-T细胞生长曲线绘制

3．3 奶牛乳腺上皮细胞总mRNA的提取

3．4 MAC-T细胞骨架蛋白—角蛋白18 mRNA的表达

3．5 RT-PCR和Western blot检测MAC-T细胞酪蛋白的表达

3．6 MAC-T细胞内TPH及5-HT受体基因的表达

3．7 5-HT浓度与作用时间对奶牛乳腺上皮细胞MAC-T增殖的影响

3．8 5-HT受体掊抗剂对5-HT作用下的MAC-T细胞增殖的影响

3．9 5-HT对细胞凋亡相关因子mRNA表达量的影响

3．10 5-HT对乳蛋白合成关键激酶和调节因子mRNA表达量的影响

4 讨论

4．1 培养体系的选择

4．2 TPH及5-HT受体基因的表达

4．3 5-HT对MAC-T细胞增殖的影响及其可能机制

4．4 5-HT对乳蛋白合成关键激酶和调节因子mRNA表达量的影响

5 结论、研究展望

5．1 结论

5．2 研究展望

参考文献

致谢