家兔PepT1的原核表达及日龄、蛋白对PepT1 mRNA表达量的影响

摘要

mRNA及蛋白质表达定量技术是研究家兔氨基酸吸收及PepT1转运特性的必要技术手段，本研究采用Real Time PCR方法测定了不同日龄的家兔肠道内PepT1、CATI、EAAC1mRNA的表达量及不同饲粮蛋白水平下的肠道内PepT1、CAT1、EAAC1mRNA的表达量。分析年龄、肠道不同部位、不同的饲粮蛋白水平对家兔小肽、碱性氨基酸、酸性氨基酸吸收的影响。为了从蛋白水平上研究小肽的吸收，本研究通过基因工程的方法建立了通过原核表达获得家兔PepT1蛋白的模型，为获取蛋白抗体，并通过蛋白水平研究家兔小肽的吸收奠定基础。
　　不同日龄家兔消化道各段PepT1、CAT1、EAAC1 mRNA的表达量分析（试验一）。试验用家兔自断奶开始维持饲料的同质化，并统一自由采食。通过荧光定量PCR的方法测定15、30、60、90日龄胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠内PepT1、CAT1、EAAC1mRNA的表达量。结果表明，同一日龄肠道各段的表达量结果，PepT1的表达量:相同日龄不同消化道之间进行表达量分析，结果各组均为回肠的表达量最(P＜0.05)。相同肠段不同日龄之间进行表达量分析，结果除结肠随年龄的增加表达量有逐渐递增的趋势外(P＞0.05)，其余各组均在60日龄时表达量达到峰值(P＜0.05)。CAT1mRNA的表达量:相同日龄不同消化道之间进行表达量分析，结果除15日龄胃中表达量最高(P＜0.05)，其余各日龄中十二指肠的表达量最高(P＜0.05)。相同肠段不同日龄之间进行表达量分析，在胃中15日龄表达量最高(P＜0.05)，盲肠在30日龄表达量最高，十二指肠、回肠、空肠、结肠在60日龄时表达量最高(P＜0.05)。EAAC1mRNA的表达量:相同日龄不同消化道之间进行表达量分析，15日龄、60日龄中空肠的表达量最高(P＜0.05)，30日龄、90日龄中回肠表达量最高(P＜0.05)，各组均为空肠、回肠表达量相对较高。相同肠段不同日龄之间进行表达量分析，、胃、盲肠中15日龄表达量最高，回肠30日龄表达量最高(P＜0.05)，十二指肠、空肠、结肠中60日龄表达量最高(P＜0.05)。
　　不同饲粮蛋白水平对家兔消化道各段PepT1、CAT1、EAAC1 mRNA的表达量的影响（试验二）。设计饲粮配方，试验分三组:低蛋白水平组、对照组、高蛋白水平组。饲粮蛋白水平设计梯度为12.8％、16％、19.2％。实测蛋白浓度值为12.4％、15.3％、17.8％。试验每组30只家兔，试验兔为断奶1月龄泰山大白兔，每天等量饲喂，试验共进行40天，每组八只屠宰采取肠道各组织样品。通过荧光定量PCR的方法测定十二指肠、空肠、回肠内PepT1、CAT1、EAAC1mRNA的表达量。结果表明，CAT1:十二指肠中对照组表达量最高，空肠、回肠中随蛋白水平的升高表达量有升高的趋势(P＜0.05)。EAAC1:在小肠中中随蛋白水平的升高表达量差异不显著(P＞0.05)，PepT1:在十二指肠、空肠、回肠中均为对照组表达量最高。
　　家兔PepTI的克隆及原核表达（试验三）。通过RT-PCR技术扩增家兔Ⅰ型肽载体CDS区编码片段，并且通过原核表达获得重组家兔Ⅰ型肽载体蛋白，奠定制备多克隆抗体的基础。结果表明，成功扩增出2001bp家兔PepT1部分CDS编码区及用于原核表达的1071bp抗原表位相对集中的基因片段;克隆载体经过DNA序列鉴定，所得基因与NCBI报道的完全一致;成功构建表达载体pET-32a-M、pET-28a-M;经IPTG诱导，表达出了6@His-M融合蛋白，用组氨酸标签抗体做Western印记证明产物大约44 ku，与预期大小相符，（结论）家兔PepTⅠ蛋白在大肠杆菌(BL21)中成功的进行了表达。

目录

声明

英文缩略词说明

摘要

前言

1．1 蛋白质的消化吸收及利用

1．2 蛋白质不足和过量对家兔的影响

1．3 小肽转运载体

1．3．1 家兔肽载体的研究进展

1．3．2 小肽在体内的吸收和代谢机制

1．3．3 PepT1的克隆，组织表达及蛋白结构

1．3．4 PepT1对小肽的转运及影响因素

1．3．5 PepT2的研究进展

1．4 氨基酸的跨膜转运

1．4．1 氨基酸转运载体的研究进展

1．4．2 两性氨基酸转运系统

1．4．3 碱性氨基酸转运系统

1．4．4 酸性氨基酸转运载体

1．4．5 其他氨基酸转运载体

1．5 研究目的及意义

2 材料与方法

2．1 试验设计

2．1．1 不同日龄肉兔消化道各段PepT1、CAT1、ECCA1mRNA表达量分析(试验一)

2．1．2 不同饲粮蛋白水平对PepT1、CAT1、EAAC1mRNA表达量的影响(试验二)

2．1．3 家兔Ⅰ型肽载体(PepTⅠ)基因的克隆与原核表达(试验三)

2．2 试验主要材料与器材

2．2．1 主要试剂

2．2．2 试验仪器

2．3 测定方法

2．3．1 肠道各段有关基因指标的测定

2．3．2 引物设计

2．3．4 血清中代谢指标的测定

2．3．5 家兔PepT1mRNA的扩增及原核表达

2．4 数据分析

3 结果与分析

3．1 不同日龄肉兔消化道各段PepT1、CAT1、ECCA1mRNA表达量分析(试验一)

3．1．1 日龄对家兔肠道内PepT1mRNA表达量的影响

3．1．2 不同日龄对家兔肠道内CAT1mRNA表达量的影响

3．1．3 不同日龄对家兔肠道内EAAC1mRNA表达量的影响

3．1．4 消化道不同部位对Pept1mRNA表达量的影响

3．1．5 消化道不同部位对CAT1mRNA表达量的影响

3．1．6 消化道不同部位对EAAC1mRNA表达量的影响

3．2 不同饲粮蛋白水平对PepT1、CAT1、EAAC1mRNA表达量的影响(试验二)

3．2．1 不同饲粮蛋白水平对前后腿肌肉沉积的影响

3．2．2 不同饲粮蛋白水平对血液生化指标的影响

3．2．3 不同饲粮蛋白水平对小肠各段PepT1mRNA基因表达量的影响

3．2．4 不同饲粮蛋白水平对小肠各段CAT1mRNA基因表达量的影响

3．2．5 不同饲粮蛋白水平对小肠各段PepT1mRNA基因表达量的影响

3．3 家兔Ⅰ型肽载体(PepT 1)基因的克隆与原核表达(试验三)

3．3．1 家兔PepT 1cDNA的PCR扩增

3．3．2 家兔PepT 1 cDNA的克隆及序列分析

3．3．3 家兔PepT1重组表达质粒的鉴定结果

3．3．4 家兔PepT1融合蛋白的诱导表达

3．3．5 重组蛋白的Western印记

4 讨论

4．1 不同日龄肉兔消化道各段PepT1、CAT1、EAAC1mRNA表达量分析(试验一)

4．1．1 日龄对家兔肠道内PepT1、CAT1、EAAC1mRNA表达量的影响

4．1．2 消化道不同部位对PepT1、CAT1、EAAC1mRNA表达量的影响

4．2 不同饲粮蛋白水平对PepT1、CAT1、EAAC1mRNA表达量的影响(试验二)

4．2．1 不同饲粮蛋白水平对生长肉兔生产性能的影响

4．2．2 不同饲粮蛋白水平对血液生化指标的影响

4．2．3 不同饲粮蛋白水平对小肠中PepT1mRNA表达量的影响

4．2．4 不同饲粮蛋白水平对小肠中CAT1mRNA表达量的影响

4．2．5 不同饲粮蛋白水平对小肠中EAAC1mRNA表达量的影响

4．3 家兔Ⅰ型肽载体(PepTⅠ)基因的克隆与原核表达(试验三)

5 总体结论与研究展望

5．1 总体结论

5．1．1 不同日龄肉免消化道各段PepT1、CAT1、EAAC1mRNA表达量分析(试验一)

5．1．2 不同饲粮蛋白水平对PepT1、CAT1、EAAC1mRNA表达量的影响(试验一)

5．1．3 家兔Ⅰ型肽载体(PepTⅠ)基因的克隆与原核表达(试验三)

5．2 课题创新与研究展望

5．2．1 课题创新

5．2．2 研究展望

参考文献

致谢