固相表面上蛋白质空间取向控制方法研究

摘要

蛋白质在固相表面的偶联技术在生物分离、酶催化、疾病诊断和分析检测等领域应用十分广泛。蛋白质在固相表面的空间取向是影响分离材料的性能、酶催化活性以及检测准确度和灵敏度的重要因素。研究蛋白在固相表面的空间取向控制对于提高亲和介质性能具有重要意义。蛋白质结构复杂，在不同条件下其表面电荷及亲疏水性存在一定差异。控制蛋白质在固相表面上的空间取向存在一定难度。本论文建立了一种以点击化学为基础的固相表面空间取向可控的生物大分子偶联新技术。利用HPLC-MS和蛋白酶解技术对蛋白在琼脂糖凝胶上偶联位点的识别方法。并对利用环氧活化偶联法偶联在介质表面的蛋白进行位点识别，进而得到其偶联位点信息。主要内容如下:
　　(1)以溶菌酶为模型，研究了一种基于点击化学的琼脂糖微球上蛋白质定点偶联方法。首先将琼脂糖微球使用1，4-丁二醇二缩水甘油醚活化后与对氨基苯乙炔反应，将炔基引入琼脂糖微球。其次合成了叠氮基癸酸，通过EDC/NHS法将叠氮基癸酸偶联到溶菌酶表面，将不同修饰位点的溶菌酶进行色谱分离后，通过点击化学使溶菌酶分子上叠氮基与琼脂糖微球表面上的炔基进行反应。采用合成的叠氮基癸酸对溶菌酶进行修饰，质谱分析结果表明叠氮基修饰主要出现三个位点，Lys1、Lys33和Lys96。将偶联位点为Lys96的溶菌酶进行了分离，通过点击化学反应将溶菌酶偶联在琼脂糖微球表面，质谱分析结果表明偶联的溶菌酶其酶解产物中未检测出多肽Gln74-Lys96，证明溶菌酶通过Lys96偶联在琼脂糖微球表面。该研究为偶联位点均一、可控的蛋白质偶联方法提供了参考。
　　(2)以蛋白A为模型，利用环氧基活化法将其偶联在琼脂糖微球上，利用HPLC-MS技术和蛋白酶解技术相结合的方法，通过对蛋白A偶联前后一次酶解多肽产物丰度的相对差异对蛋白A在琼脂糖微球4FF上偶联位点进行识别。琼脂糖表面的蛋白A的偶联位点发生在K99、 K447、K459和K470与琼脂糖微球表面偶联的SpA所占比例分别为，偶联位点比例分别为99％，72％、87％和97％，表明了蛋白酶解结合多肽序列分析是一种有效的识别蛋白偶联位点的方法。
　　以点击化学为基础的生物大分子定向偶联技术，将叠氮化合物修饰的生物大分子与表面带有炔基的固相表面进行偶联，实现生物大分子在固相表面上的均一性控制，利用HPLC-MS和蛋白酶切技术结合，可以有效识别不同蛋白在介质表面的偶联位点。

目录

声明

符号说明

摘要

1 引言

1．1 蛋白偶联技术概况

1．2 蛋白质共价偶联技术及应用

1．2．1 蛋白分子内天然官能团偶联

1．2．3 以非天然官能团为偶联基团

1．3 点击化学

1．3．1 点击化学的反应特征

1．3．2 点击化学的反应类型

1．3．3 点击化学的应用

1．4 蛋白质偶联位点的识别方法

1．4．1 核磁共振技术NMR

1．4．2 飞行时间二级离子质谱法

1．4．3 MALDI-TOF MS和酶解法结合

1．4．4 酶联免疫法

1．4．5 其他方法

1．5 亲和层析介质

1．5．1 亲和层析介质的研究进展

1．5．2 亲和层析介质的制备方法

1．6 立题依据与研究内容

1．6．1 立题依据

2 材料与方法

2．1 材料与试剂

2．1．1 原料

2．1．2 化学试剂

2．1．3 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 基于点击化学定向偶联方法

2．2．2 蛋白偶联及位点识别方法

3 结果与分析

3．1 基于点击化学的定点偶联

3．1．1 叠氮基修饰剂合成与表征

3．1．2 溶菌酶化学修饰产物分析

3．1．3 偶联对氨基苯乙炔前后琼脂糖微球XPS分析

3．1．4 基于点击化学的溶菌酶定点偶联产物分析

3．2 蛋白A偶联琼脂糖位点分析

3．2．1 胰蛋白酶酶解分析蛋白A偶联位点

3．2．2 糜蛋白酶酶解分析蛋白A偶联位点

4 讨论

4．1 基于点击化学的定点偶联方法

4．2 蛋白A偶联位点识别方法

5 结论

5．1 主要研究成果

5．2 创新点

参考文献

致谢

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