拟南芥STM、WUS和CLV3相互作用调控茎端分生组织干细胞活性的研究

摘要

茎端分生组织是植物茎、叶和花等地上部分器官发生的来源。茎端分生组织的组织中心和其上方的干细胞构成的干细胞微环境是维持分生组织的基础。WUSCHEL（WUS）编码组织中心的关键调控因子，能够诱导干细胞特征基因CLAVATA3(CLV3)在组织中心上方的细胞中表达，并赋予它们干细胞的特征。尽管目前对WUS的功能有了一定的认识，但是对于WUS如何调节干细胞命运的机制尚需进一步深入研究。本研究中我们筛选到多个拟南芥WUS互作蛋白，其中包括茎端分生组织特异调控因子SHOOT MERISTEMLESS(STM)。我们的研究结果发现，WUS和STM发生直接的相互作用，并能共同结合CLV3基因的启动子以激活其表达，从而调控茎端分生组织干细胞的活性。主要研究结果和结论如下:
　　(1)STM蛋白与WUS蛋白之间存在直接的相互作用
　　为了进一步揭示WUS蛋白在调控茎端分生组织发育过程中的分子机理，我们利用免疫共沉淀联合蛋白质谱技术，寻找WUS蛋白在调控茎端分生组织发育过程中的互作因子。实验结果显示，SHOOT MERISTEMLESS(STM)蛋白与WUS蛋白在拟南芥体内存在直接的相互作用。STM基因对茎端分生组织的建成与维持都具有非常重要的作用。我们利用Pull-Down、酵母双杂交等实验进一步证实两者之间存在直接的相互作用。
　　(2)STM基因与WUS基因表达模式的分析
　　利用激光共聚焦显微镜对pSTM∷STM-VENUS与pWUS∷WUS-3 GFP转基因植株中STM基因与WU基因的表达模式进行了分析，发现最早在16细胞胚时期检测到了WUS蛋白的信号，而此时并未检测到STM蛋白的出现;而在三角形胚时期，心形胚时期，WUS蛋白与STM蛋白的信号都是共定位的;在幼苗期及生殖发育阶段，整个茎端分生组织充满了STM蛋白的信号，而WUS蛋白的信号集中在组织中心区域，包含在STM蛋白的表达范围之内。
　　(3)STM蛋白直接调控CLV3基因的表达
　　我们检测了stm突变体与STM基因过表达的转基因植株中CLV3基因的表达量，RT-PCR结果显示，与野生型相比，在stm突变体中CLV3基因的表达量明显下降，而利用地塞米松诱导的35S∷STM-GR的转基因植株中，CLV3的表达量显著升高。
　　经过分析启动子结构，我们发现CLV3基因启动子区域存在STM蛋白特异结合的核心序列，STM蛋白能否直接调控CLV3基因的表达呢？染色质免疫共沉淀(ChIP)实验表明，在拟南芥植株体内STM蛋白与CLV3基因之间存在着相互作用。经过凝胶迁移率实验(EMSA)进一步验证，STM蛋白可以直接结合在CLV3基因的启动子上激活其表达。
　　(4)STM与WUS蛋白相互作用共同调控CLV3基因的表达
　　利用CLV3启动子启动CLV3基因全长互补clv3-2突变体，恢复了野生型表型;而分别突变CLV3基因启动子上WUS蛋白或STM蛋白的结合位点之后启动CLV3基因全长互补clv3-2突变体，均只能部分恢复突变体表型;当同时突变CLV3基因启动子上WUS与STM蛋白的结合位点之后互补clv3-2突变体，突变体的表型则完全不能恢复。另外，将拟南芥植株中STM勺表达量下调之后，WUS蛋白对CLV3基因的结合能力明显下降;同时，若将植株中WUS的表达量下调之后，STM蛋白对CLV3的结合能力也呈现显著降低的趋势。
　　(5)CLV3与STM之间存在反馈调节机制
　　本实验中利用qRT-PCR对clv3突变体中STM因的表达量进行了检测，发现在clv3突变体中STM基因的表达量与野生型相比有了显著提高。原位杂交结果显示，clv3突变体中STM基因的转录产物也有明显的增加。以上实验结果说明，在茎端分生组织的发育过程中，CLV3基因会抑制ST基因的表达，从而在两者之间形成了一个类似于CLV3-WUS之间的反馈调节环。
　　综上所述，STM蛋白在调控茎端分生组织发育的过程中与WUS蛋白存在直接的相互作用，同时STM蛋白还能够直接结合到CLV3基因的启动子上激活CLV3基因的表达。因此，STM与WUS蛋白可以相互作用共同调控CLV3基因的表达，当CLV3蛋白积累到一定量之后会反过来抑制STM基因与WUS基因的表达，从而维持茎端分生组织中干细胞的数量。研究结果为进一步分析拟南芥茎端分生组织干细胞发育的调控机制提供了新的思路。

目录

声明

符号说明

摘要

1 前言

1．1 植物分生组织

1．1．1 植物分生组织的发育

1．1．2 植物分生组织与植物生长发育

1．2 茎端分生组织的结构

1．2．1 茎端分生组织的细胞学分区

1．2．2 茎端分生组织的胚性起始

1．2．3 茎端分生组织活性的维持

1．3 茎端分生组织干细胞

1．3．1 茎端分生组织干细胞的细胞学特征

1．3．2 茎端分生组织干细胞的起始与终止

1．3．3 茎端分生组织干细胞在侧生器官分化中的作用

1．4 茎端分生组织干细胞的分子遗传调控

1．4．1 WUS基因调控茎端干细胞的活性

1．4．2 CLV基因调控茎端干细胞的活性

1．4．3 调控茎端干细胞形成和维持的CLV-WUS反馈调节机制

1．4．4 WUS与STM基因在调控茎端干细胞发育中共同起作用

1．5 植物干细胞与动物干细胞的区别

1．6 本研究的目的及意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 植物材料及生长条件

2．1．2 菌株和质粒

2．1．3 酶、生化试剂及仪器

2．1．4 常用缓冲液及培养基的配制

2．2 实验方法

2．2．1 拟南芥的种植方法

2．2．2 植物基因组的提取及纯化

2．2．3 PCR扩增实验

2．2．4 植物总RNA的提取

2．2．5 反转录cDNA第一链的合成

2．2．6 实时定量PCR分析

2．2．7 根癌农杆菌菌株GV3101感受态细胞的制备与细胞转化

2．2．8 拟南芥的转化

2．2．9 表达载体的构建

2．2．10 蛋白表达纯化

2．2．11 酵母单杂交实验

2．2．12 酵母双杂交实验

2．2．1 3 Pull-Down实验

2．2．14 凝胶迁移率实验EMSA

2．2．15 染色质免疫共沉淀(ChIP)

2．2．16 免疫共沉淀(Co-IP)

2．2．17 共聚焦显微镜观察和图像处理

2．2．18 基因枪轰击拟南芥茎端实验

2．2．19 原位杂交分析

3 结果与分析

3．1 免疫共沉淀结合质谱分析寻找WUS蛋白的互作因子

3．1．1 pWUS∷WUS-3GFP转基因植株的鉴定

3．1．2 免疫共沉淀结合质谱实验过程

3．2 WUS蛋白与STM蛋白存在直接的相互作用

3．2．1 酵母双杂交实验证实STM蛋白与WUS蛋白之间存在相互作用

3．2．2 Pull-Down实验证实STM蛋白与WUS蛋白存在相互作用

3．2．3 免疫共沉淀结果证实STM蛋白与WUS蛋白在拟南芥体内存在直接相互作用

3．3 STM基因与WUS基因在拟南芥不同发育时期的表达模式

3．4 STM蛋白对CLV3基因的表达调控

3．5 STM蛋白直接调控CLV3基因的转录

3．5．1 ChIP实验证实在拟南芥体内存在STM蛋白对CLV3基因的调控作用

3．5．2 EMSA实验显示STM蛋白可以直接结合到CLV3基因的启动子上

3．5．3 酵母单杂交实验证实STM蛋白与CLV3基因之间存在直接的相互作用

3．5．4 瞬时转化实验显示STM蛋白直接激活CLV3基因的表达

3．6 STM蛋白与WUS蛋白共同参与了对CLV3基因的表达调控

3．6．1 STM蛋白与WUS蛋白可以同时结合到CLV3基因的启动子上

3．6．2 STM蛋白与WUS蛋白共同激活CLV3基因的表达

3．6．3 CLV3基因的正常表达受到STM与WUS蛋白共同调控

3．7 CLV3与STM基因之间存在反馈调节机制

4 讨论

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况