维生素K环氧化物还原酶(VKOR)功能位点对植物生长及光系统Ⅱ活性影响的研究

摘要

维生素K环氧化物还原酶(Vitamin K epoxide reductase，VKOR)是存在于高等动物内质网上的整合膜蛋白，在高等植物中，VKOR的同源蛋白则定位于叶绿体类囊体膜上。拟南芥VKOR(AtVKOR)的缺失会造成植株生长迟缓、植株矮小、花期晚等生长缺陷。AtVKOR具有氧化还原酶活性且此活性与蛋白中的保守半胱氨酸直接有关，而AtVKOR在植物生长过程中的功能是否由氧化还原酶活性引起还未知。为此，我们对AtVKOR编码序列的半胱氨酸位点进行突变、构建表达载体并转化拟南芥vkor缺失突变体，获得纯合体后，分析转基因植株的生长表型及在不同光强条件下的光系统Ⅱ(PSⅡ)活性变化，探究了AtVKOR蛋白功能位点对植株的光合生长、PSⅡ活性的影响。主要研究结果如下:
　　(1)将AtVKOR编码基因的半胱氨酸位点(Cysteine，Cys)进行突变、构建表达载体并转化拟南芥vkor缺失突变体，获得转基因植株。将AtVKOR的8个保守半胱氨酸（两对位于VKOR膜结构域，两对位于Trx-like水溶性结构域）和2个非保守半胱氨酸分别或成对突变为丙氨酸(Ala)，共构建了10个cysteine-mutant AtVKORs表达载体，通过花絮浸染转化拟南芥野生型和vkor突变体的杂合体，获得种子后，对下一代幼苗进行抗生素筛选、外源基因PCR鉴定及vkor突变体背景筛选，在T2代获得vkor突变体转AtVKORWT和转cysteine-mutant AtVKORs纯合转基因植株。
　　(2)转cysteine-mutant AtVKORs对植株生长的影响。野生型AtVKOR(AtVKORWT)转化拟南芥vkor缺失突变体后可以完全补偿突变体的生长缺陷，而转cysteine-mutantAtVKORs对植株的生长产生了不同的影响。VKOR结构域上的保守半胱氨酸(Cys109、Cys116、Cys195、Cys198)突变后比Trx-like结构域上的保守半胱氨酸(Cys293、Cys296、Cys316、Cys331)突变对植株生长的影响大，其中转AtVKORC109AC116A和AtVKORC195AC198A几乎不能补偿突变体的生长缺陷，与vkor突变体的表型相似;而Trx-like结构域上保守半胱氨酸突变后能部分补偿突变体的生长缺陷;两个非保守半胱氨酸突变后，几乎能够完全恢复突变体的生长，与转AtVKORWT的表型相似。结果说明保守半胱氨酸特别是VKOR结构域的保守半胱氨酸对植物VKOR蛋白的功能起关键作用，暗示vkor突变体生长缺陷表型是由AtVKOR的氧化还原酶的活性位点突变引起的。
　　(3) AtVKOR半胱氨酸位点对植物光系统Ⅱ(PSⅡ)反应中心活性的影响。叶绿素荧光参数反映植物PSⅡ反应中心的活性，与转AtVKORWT叶片的荧光参数相比，突变不同位点的cysteine-mutant AtVKORs对其荧光参数产生不同影响。正常光照下，VKOR结构域的保守半胱氨酸突变后对其最大光化学效率(Fv/Fm)影响显著，其中AtVKORC109AC116A和AtVKORC195AC198A的Fv/Fm分别比AtVKORWr下降约24％和22％;Trx-like结构域的保守半胱氨酸突变后，Fv/Fm下降10％至13％;非保守半胱氨酸突变后，Fv/Fm值与AtVKORWT无显著差异;强光处理加剧了转cysteine-mutant AtVKORs植株之间的Fv/Fm值的差异。实际光化学效率(ΦPSⅡ)的变化趋势与Fv/Fm的相似。
　　(4) AtVKOR半胱氨酸位点对PSⅡ核心蛋白-D1周转的影响。D1蛋白周转是植物减少光抑制的有效途径之一。与转AtVKORWT植株相比，强光下转AtVKORC109AC116A和AtVKORC195AC198A植株中D1蛋白含量大大降低，与vkor突变体的D1含量接近，仅有痕量的D1蛋白存在;Trx-like结构域上的保守半胱氨酸突变后，D1含量略有降低;而非保守半胱氨酸突变后，植株中D1含量变化趋势与转AtVKORWT相似。
　　(5) AtVKOR半胱氨酸位点对植株体内活性氧(ROS)积累量的影响。植物光抑制伴随活性氧的积累，AtVKOR保守半胱氨酸突变后，植株中H2O2和O2·-的积累量显著增加;特别是成对突变VKOR结构域的保守半胱氨酸后，植株中的ROS积累量与vkor突变体中相当，比转AtVKORWT增加约56％。突变非保守半胱氨酸后，植株的ROS积累量与未突变的AtVKORWT维持相似水平。
　　研究结果表明，AtVKOR蛋白中的半胱氨酸残基特别是VKOR膜结构域中的保守半胱氨酸对该蛋白在植物生长发育中的功能影响极大，AtVKOR在调控植物PSⅡ组装、保持PSⅡ活性、参与D1蛋白周转及维持ROS平衡中的功能与该蛋白的氧化还原酶活性相关，为进一步探究植物VKOR蛋白在叶绿体巯基/二硫键氧化还原调控机制中的功能奠定了基础。

目录

声明

符号说明

摘要

1 前言

1．1 蛋白质中半胱氨酸的巯基／二硫键转换

1．1．1 蛋白质中半胱氨酸侧链巯基的修饰

1．1．2 蛋白质中半胱氨酸残基的巯基／二硫键的转换机制

1．1．3 半胱氨酸的巯基／二硫键对蛋白质功能的调控作用

1．2 催化二硫键形成的酶系统及半胱氨酸位点的功能分析

1．2．1 大肠杆菌Dsb酶系统中半胱氨酸位点的功能分析

1．2．2 结核分支杆菌VKOR酶系统中半胱氨酸位点的功能分析

1．2．3 哺乳动物VKOR酶系统中半胱氨酸位点的功能分析

1．2．4 聚球藻VKOR酶系统中半胱氨酸位点的功能分析

1．3 植物叶绿体中类囊体蛋白的研究

1．3．1 植物类囊体的蛋白家族

1．3．2 植物类囊体蛋白的转运及氧化折叠

1．3．3 植物类囊体蛋白对环境的响应

1．3．4 植物类囊体中光系统Ⅱ(PSⅡ)的组装及修复

1．3．5 植物类囊体中的光保护机制的研究

1．4 植物维生素K环氧化物还原酶(VKOR)的研究进展

1．5 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 菌株和质粒

2．1．2 植物材料

2．1．3 酶、试剂盒与各种生化试剂

2．1．4 PCR引物

2．2 实验方法

2．2．1 半胱氨酸突变的AtVKOR克隆载体的构建

2．2．2 Cysteine-mutant AtVKORs植物表达载体的构建

2．2．3 Cysteine-mutant AtVKORs表达载体转化农杆菌

2．2．4 农杆菌浸染拟南芥

2．2．5 转基因植株的获得及筛选

2．2．6 检测转基因植株中cysteine-mutant AtVKORs的表达量

2．2．7 转基因植株生理指标的测定

2．2．8 Western blot蛋白印迹分析

2．2．9 H2O2与O2·-含量的测定

3 结果与分析

3．1 构建cysteine-mutant AtVKORs植物表达载体

3．1．1 Cysteine-mutant AtVKORs片段的扩增及克隆载体的构建

3．1．2 AtVKOR信号肽序列的扩增及添加

3．1．3 构建cysteine-mutant AtVKORs植物表达载体及转化农杆菌

3．2 Cysteine-mutant AtVKORs转基因植株的获得

3．2．1 野生型拟南芥与vkor缺失突变体杂交材料的获得

3．2．2 农杆菌浸染花絮及转基因植株的获得

3．2．3 转基因植株纯合体的筛选及鉴定

3．3 AtVKOR半胱氨酸位点对植物生长的影响

3．4 AtVKOR半胱氨酸位点对植物光系统Ⅱ(PSⅡ)反应中心的影响

3．4．1 正常光照下AtVKOR半胱氨酸位点对PSⅡ活性的影响

3．4．2 强光条件下AtVKOR半胱氨酸位点对PSⅡ活性的影响

3．5 AtVKOR半胱氨酸位点对植物PSⅡ核心蛋白-D1周转的影响

3．6 AtVKOR半胱氨酸位点对植株体内ROS积累量的影晌

4 讨论

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的论文