结肠癌中CacyBP/SIP核转位后相关信号通路差异表达基因的筛选及验证

摘要

目的：结肠癌发病率呈逐年上升的趋势，但目前对结肠癌的发病机制仍不清楚。钙周期素结合蛋白（Calcyclin-binding protein，CacyBP/SIP）主要表达于细胞质中。本课题组前期研究发现，胃泌素刺激结肠癌细胞观察到CacyBP/SIP具有核转位现象，且促进结肠癌细胞增殖。本研究以期进一步筛选CacyBP/SIP核转位后下游相关信号通路差表达基因并验证，探究其在结肠癌发生发展中的可能作用，为探索CacyBP/SIP入核后下游结合分子的信号通路提供研究方向。
　　方法：选用慢病毒包装的含目的基因CBP-SBP-CacyBP-3X Nuclear targeting sequences病毒上清液感染的SW480结肠癌细胞；采用细胞周期PCR芯片和泛素化途径信号通路PCR芯片筛选出差异表达基因；采用胃泌素刺激CacyBP/SIP进入细胞核，用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白免疫印迹(Western Blot)验证五个差异表达倍数大于2的基因进行核酸和蛋白表达水平。
　　结果：1.蛋白免疫印迹验证慢病毒包装含目的基因CacyBP/SIP由CBP标签带核定位信号的质粒转染后的SW480细胞胞核中CacyBP/SIP蛋白稳定高表达。2.细胞周期和泛素化途径信号通路PCR芯片共168个基因。其中细胞周期PCR芯片有84个基因，其中有72个分子个表达上调,12个分子表达下调。泛素（泛素化）PCR芯片共84个基因，其中有66个分子表达上调，18个分子表达下调。差异表达倍数大于2的基因有5个：CASP3,BRCA2,CKS2,CDK8表达上调，PARK2表达下调。3.10-7mol/L胃泌素刺激SW480细胞48h成功制备了CacyBP/SIP入核的细胞模型。4.qRT-PCR验证5个差异基因其差异CASP3，BRCA2，CKS2，和CDK8表达上调，差异表达倍数为：BRCA2为1.92，CDK8为2.38；CKS2为2.25；CASP3为1.82，PARK2表达下调差异表达倍数为0.133。统计学分析，BRCA2无统计学意义，其余四个均有统计学差异。CacyBP/SIP入核后胞核中CDK8，CKS2,CASP3,BRCA2蛋白水平表达上调，蛋白PARK2表达下调。
　　结论：CacyBP/SIP入核后通过对细胞周期和泛素化途径的调控促进结肠癌细胞增殖；CacyBP/SIP入核后通过对CDK8,CKS2,PARK2调节促进结肠癌细胞增殖。

目录

声明

中英文缩略词

前言

第一部分 CacyBP/SIP入核后下游相关信号通路的差异表达基因的筛选

材料及方法

1 实验材料

2.方法

结果

1 蛋白免疫印迹法验证CacyBP/SIP慢病毒表达质粒感染结肠癌SW480细胞成功

2 RNA浓度及完整性检测验证RNA提取成功

3 CacyBP/SIP入核后相关信号通路PCR芯片的差异表达基因

讨论

第二部分 CacyBP/SIP入核后从mRNA和蛋白水平验证筛选的差异表达基因

材料与方法

1.1 实验材料

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

1.4溶液配制

2 研究方法

2.1细胞培养 同第一部分

2.2.胞浆胞核蛋白提取及SDS-Page电泳 同前

2.3 TRIZOL法分别提取实验组和对照组细胞总RNA

2.4 RNA反转录成cDNA

2.5 用PCR对反转录产物进行验

2.6 qRT-PCR检测CacyBP/SIP核转位前后差异表达基因表达水平

2.7数据分析：

2.8Western blot检测胃泌素刺激前后筛选出来的的差异因子蛋白表达

1Western Blot检测10-7mol/L的胃泌素刺激前后CacyBP/SIP表达定位:CacyBP/SIP核表达模型构建成功

2 从核酸水平验证五个差异表达基因的表达水平

3 Western blot检测CacyBP/SIP入核前、后五差异表达基因的蛋白表达

讨论

结论

参考文献

综述:CacyBP/SIP生物学功能研究进展

致谢

攻读学位期间发表的论文