中枢过表达ACE2降低胆碱能突触传递机制在改善高血压中的作用研究

摘要

高血压（Hypertension）一直是心血管领域的研究重点，因其并发脑卒中、冠心病和心力衰竭等严重心血管疾病，严重影响人类健康。血压升高和交感神经活动亢进是高血压心血管功能紊乱的主要特征，并与高血压并发症的预后发展密切相关。头端延髓腹外侧区（RVLM）是维持基础血压和调控交感输出的关键中枢，其结构和功能异常是高血压病理改变的一个重要机制。研究表明RVLM胆碱能突触传递（Cholinergic synaptic transmission）在自发性高血压大鼠（SHR）中是明显增强的，因此其增强机制在诱发SHR的血压升高和交感神经过度兴奋中具有重要作用。如何有效降低RVLM内胆碱能突触传递对改善高血压心血管功能紊乱的机制策略研究具有重要意义。
　　众所周知，肾素—血管紧张素系统(Renin-angiotensin system,RAS)的异常活动与高血压的发生发展密切相关。ACE2-Ang(1-7)-MAS轴是近年研究发现的RAS新途径，作为血管紧张素转换酶（ACE）的同系物，ACE2可以催化AngⅡ生成Ang(1-7），Ang(1-7)可以特异性作用于G蛋白偶联Mas受体产生与AngII效应相反的心血管保护作用，因此ACE2-Ang(1-7)-MAS轴可能会成为治疗高血压的一个潜在新靶点。有研究证实SHR的RVLM内过表达ACE2可以引起长效的降血压效应，但目前并不清楚ACE2是否通过减弱 RVLM内胆碱能途径从而产生改善高血压的作用？因此本研究的主要目标是明确ACE2过表达对高血压大鼠RVLM内胆碱能突触传递的作用及其可能机制。
　　炎症刺激诱导的氧化应激水平增强是RVLM神经元兴奋性增强的一个重要机制。AngⅡ是一种前炎症因子，有显著的促炎作用，AngⅡ的增加通过激活胶质细胞NF-κB和AP-1等转录因子活性而增强炎症因子的表达并诱导产生活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)介导的氧化应激。因此，也将明确ACE2过表达是否具有抑制高血压大鼠RVLM内炎症因子合成的作用。
　　方法：本实验通过采用慢病毒载体将ACE2（Lenti-ACE2）过表达于SHR及WKY大鼠RVLM后，每周在相同时间段运用大鼠尾动脉无创性血压监测系统，监测其清醒状态下血压和心率的变化；高效液相色谱法检测24小时尿中去甲肾上腺素（NE）含量，从而明确交感神经活动的活性；Western-blot方法检测RVLM内ACE2基因转染后ACE2的表达情况等来验证ACE2的转染效率。在ACE2过表达的大鼠上，对乙酰胆碱及其受体系统相关指标进行了检测。转染ACE2六周后，通过用试剂盒检测RVLM微透析液中乙酰胆碱（ACh）的含量，来观察过表达ACE2后ACh含量有无明显变化；用Western-blot检测 MasR的表达变化，明确 ACE2-Ang（1-7）-MAS轴的变化，并通过Western-blot检测囊泡乙酰胆碱转运体（VAChT）、ACh作用受体M2R、氧化应激相关酶NOX4和SOD1蛋白表达情况；用ELISA试剂盒检测细胞因子TNFα，IL-1β，IL-6的含量变化；从整体动物水平，在大鼠RVLM内急性微量注射乙酰胆碱阻断剂阿托品，观察其对大鼠血压、心率、肾交感神经放电活动等指标的影响，从而明确其受体功能的变化。
　　结果：1．RVLM内过表达ACE2对血压和心率的影响
　　本实验分为WKY，SHR-GFP，SHR-ACE2三组。RVLM内未转染ACE2之前，SHR组与WKY组血压及心率存在显著差异(P<0.05)。第1周（未转染之前）SHR大鼠的MAP（182±7mmHg）和HR[351±16beats per min(bpm)]均明显（P<0.05）高于正常血压对照WKY大鼠的MAP（138±5mmHg）和HR（321±29bpm）。SHR分别转染Lenti-ACE2组和Lenti-GFP组转染后前3周收缩压、舒张压、平均动脉压均无明显差别。转染后第4周SHR转染Lenti-ACE2组的MAP（149±3mmHg）明显低于SHR转染Lenti-GFP的MAP（181±8mmHg）。SHR分别转染Lenti-ACE2组和Lenti-GFP组转染后前3周心率无明显变化，SHR转染Lenti-ACE2第4周开始出现降低，但无统计学差异，第5周开始SHR转染Lenti-ACE2组的心率（289±11bpm）明显低于SHR转染Lenti-GFP组的心率（349±15bpm）。
　　2．SHR大鼠RVLM内转染ACE2后对24小时尿液中的NE含量的影响
　　分别对WKY，SHR转染Lenti-GFP和Lenti-ACE2后6周，用高效液相色谱法进行24小时尿液中去甲肾上腺素含量测定，观察各组交感活动的变化情况。实验结果发现，SHR大鼠转染Lenti-GFP组后6周24小时尿液中去甲肾上腺素含量（0.1664±0.021μg/24h）显著高于WKY组（0.042±0.008μg/24h）。而SHR大鼠RVLM内转染Lenti-ACE2后6周24小时尿液中去甲肾上腺素含量（0.046±0.004μg/24h）显著低于SHR大鼠转染Lenti-GFP组，与正常WKY组相比无差异。
　　3．SHR大鼠RVLM内转染ACE2对ACE2-Ang(1-7)-Mas轴表达的作用
　　结果显示，SHR大鼠转染Lenti-GFP组ACE2/α-tubulin表达（0.088±0.009）显著低于正常WKY组ACE2/α-tubulin（0.147±0.018），而SHR大鼠RVLM内转染Lenti-ACE2后6周ACE2/α-tubulin（0.122±0.013）显著高于SHR大鼠转染Lenti-GFP组，与正常WKY组相比无差异。SHR大鼠RVLM内转染Lenti-ACE2后6周，ACE2的表达明显上调，与降压的效果相对应。SHR大鼠转染Lenti-GFP组MasR/α-tubulin表达（0.482±0.008）显著低于正常WKY组MasR/α-tubulin（0.861±0.015），而SHR大鼠RVLM内转染Lenti-ACE2后6周MasR/α-tubulin（0.877±0.012）显著高于SHR大鼠转染Lenti-GFP组，与正常WKY组相比无差异。
　　4．RVLM内过表达ACE2对RVLM内乙酰胆碱神经递质的影响
　　SHR大鼠转染Lenti-GFP组6周RVLM微透析液中ACh浓度（12.97±1.672μg/mL）显著（P<0.05）高于WKY组（5.69±0.517μg/mL），SHR大鼠转染Lenti-ACE2后6周RVLM微透析液中ACh含量（7.017±0.932μg/mL）显著（P<0.05）低于SHR大鼠转染Lenti-GFP组，但仍然稍高于正常WKY组。
　　5．RVLM内表达ACE2对RVLM内VAChT、M2R、NOX4和SOD1蛋白表达的影响
　　SHR大鼠转染Lenti-GFP组VAChT/α-tubulin表达（0.1139±0.016）显著（P<0.05）低于WKY组VAChT/α-tubulin（0.061±0.009），而SHR大鼠RVLM内转染Lenti-ACE2后6周VAChT/α-tubulin（0.066±0.008）显著（P<0.05）高于SHR大鼠转染Lenti-GFP组，与正常WKY组相比无差异。SHR大鼠转染Lenti-ACE2后NOX4/α-tubulin显著低于SHR大鼠转染Lenti-GFP组，与WKY组相比无差异。SHR大鼠转染Lenti-ACE2后，SOD1/α-tubulin显著高于SHR大鼠转染Lenti-GFP组，与WKY组相比无差异。M2R/α-tubulin三组比较无差异。6．RVLM过表达ACE2对M型乙酰胆碱受体介导的紧张性心血管活动的影响
　　SHR大鼠转染Lenti-GFP组6周RVLM核团微量注射硫酸阿托品(M型乙酰胆碱受体阻断剂)2 nmol后的MAP降低程度（55±4 mmHg）显著（P<0.05）高于WKY组（15±1 mmHg）。SHR大鼠转染Lenti-ACE2后6周RVLM微量注射硫酸阿托品2 nmol后的MAP降低程度（23±7mmHg）显著（P<0.05）低于SHR大鼠转染Lenti-GFP组，但仍然稍高于正常WKY组。而WKY组HR降低程度（10±3bpm），SHR大鼠转染Lenti-GFP组HR降低程度（12±5bpm）和大鼠转染Lenti-ACE2组HR降低程度（17±5bpm）无显著差异。
　　7．SHR RVLM过表达ACE2后对炎症细胞因子含量变化的影响
　　结果显示，SHR大鼠转染Lenti-GFP组TNFa，IL-1β含量显著（P<0.05）低于正常WKY组，而SHR大鼠RVLM内转染Lenti-ACE2后6周显著（P<0.05）高于SHR大鼠转染Lenti-GFP组，与正常WKY组相比无差异。
　　结论：本研究结果显示在SHR大鼠RVLM内ACE2过表达明显降低SHR的RVLM胆碱能突触传递功能，并具有抑制炎症因子生成的作用。以上结果提示中枢过表达ACE2改善高血压的作用与RVLM胆碱能突触传递的减弱有关，并可能通过降低炎症因子介导的氧化应激水平的作用途径。

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前言

材料与方法

一、实验动物

二. 主要实验仪器、材料与试剂

实验结果

一．慢病毒感染ACE2表达效果验证

二．RVLM内过表达ACE2后降低SHR的血压，心率和交感活动

讨论

结论

参考文献

综述

参考文献

致谢