玉米中ZmPIFs基因的克隆与功能分析

摘要

光对植物的生长发育起着重要的作用，一方面它不仅为植物带来了能量，使植物通过光合作用完成了同化物的积累；另一方面光又扮演了信号分子的角色，使植物通过感应光的变化调整自身的生长发育。植物通过体内的光敏色素（phytochrome，PHY）感知光信号，并通过光敏色素互作因子（phytochrome-interacting factors，PIFs）与光敏色素的相互作用调节植物的生长过程。PIFs对拟南芥的生长发育起着至关重要的作用，促进下胚轴的伸长，并抑制子叶的张开，还有抑制光形态建成。目前对于PIFs的研究主要集中于模式植物，而对一些高等作物尤其是玉米中ZmPIFs的研究还较少。因此，对玉米中ZmPIFs基因家族的研究有着重要的意义。在本实验中，我们从玉米基因数据库MaizeGDB中确定了玉米ZmPIFs基因家族的成员，探究了该基因家族的表达模式，分离得到了10个玉米基因。将其中4个基因转入拟南芥，结果发现bHLH44基因在抑制光形态建成和影响植株响应重力方面具有重要作用。主要结果如下：
　　（1）根据NCBI上查询的拟南芥AtPIFs基因家族序列，将其在MaizeGDB上进行BLAST分析，获得了17个玉米ZmPIFs同源基因。通过进化树比对、基因序列分析、氨基酸序列分析和蛋白结构域预测，初步分析、预测了玉米ZmPIFs基因的结构与功能。最终确定了10个与拟南芥AtPIF1，AtPIF3，AtPIF4和AtPIF5同源且起主要作用的玉米ZmPIFs基因：ZmbHLH12、ZmbHLH30、ZmbHLH37、ZmbHLH40、ZmbHLH44、ZmbHLH51、ZmbHLH74、ZmbHLH88、ZmbHLH113和ZmbHLH180。由于PIFs基因属于bHLH基因家族，所以我们对玉米ZmPIFs基因的命名使用了其在bHLH基因家族中的编号。
　　实时荧光定量PCR和RNA-seq高通量测序分析表明，我们发现玉米ZmPIFs基因的表达模式存在特异性：在不同的组织部位、不同的发育时期、不同基因对遮阴后的响应；并且发现bHLH24和bHLH74两个基因在短日照下的表达存在昼夜节律。
　　（2）克隆出10个玉米ZmPIFs基因：bHLH1、bHLH12、bHLH24、bHLH30、bHLH40、bHLH44、bHLH51、bHLH113、bHLH130和bHLH180。结合基因序列的正确性、结构域的完整性和是否在玉米中起主要作用，将其中的部分玉米ZmPIFs基因转入到拟南芥pifq缺失突变体和野生型Col中。通过进一步验证，发现bHLH44基因对于抑制光形态建成的作用最明显：在黑暗环境中， bHLH44促进了35S:bHLH44-3FLAG/pifq和35S:bHLH44-3FLAG/Col的下胚轴长度，改变了35S:bHLH44-3FLAG/pifq的子叶张开程度。其抑制光形态建成的功能类似于AtPIFs基因。
　　（3）bHLH44基因影响了植株的向重力性，在黑暗环境中，缺失突变体pifq的下胚轴不存在负向地性，而35S:bHLH44-3FLAG/pifq和野生型Col的下胚轴响应重力。我们通过I2-KI染色实验检测植株体内的淀粉合成情况解释了转基因幼苗可以感应重力的原因，bHLH44基因像拟南芥AtPIF1基因一样，阻止了植株体内胚层造粉体向白色体的转换。

目录

声明

符 号 说 明

1前言

1.1 PIFs是一类转录因子

1.2 PIFs在光信号通路中的作用

1.2.1 PIFs蛋白的结构

1.2.2 phy调节PIF的含量和活性，而PIF又负反馈调节phyB的水平

1.2.3 PIFs和phy的相互拮抗影响幼苗生长的各个阶段

1.2.4 PIFs调控的转录网络在幼苗各个生长时期的作用

1.2.5 PIFs靶基因的功能描述

1.3 PIFs对各路信号途径的综合

1.3.1与激素信号途径的相互影响

1.3.2 PIFs的表达受生物钟信号的调控

1.4 PIFs在作物中的研究进展

1.5 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2.1 植物材料

2.1.2 植物材料培养与处理

2.1.3 菌株与载体

2.1.4 酶和各种生化试剂

2.1.5 PCR引物

2.2 实验方法

2.2.1 qRT-PCR分析玉米ZmPIFs基因家族的表达

2.2.2 对遮阴玉米RNA-seq中ZmPIFs基因表达量变化的分析

2.2.3 植物总RNA的提取

2.2.4 cDNA第一条链的合成

2.2.5 玉米ZmPIFs基因家族的克隆

2.2.6 真核表达载体的构建及拟南芥转化

3 结果与分析

3.1 玉米ZmPIFs基因家族成员的确定

3.1.1 玉米ZmPIFs基因家族成员的序列分析和结构域预测

3.1.2 玉米ZmPIFs基因家族成员氨基酸保守性分析和蛋白结构域预测

3.2 玉米ZmPIFs基因家族成员时空表达特异性的检测

3.2.1 玉米ZmPIFs基因家族成员在短日下的节律性表达

3.2.2 玉米ZmPIFs基因家族成员在玉米不同部位表达差异的检测

3.2.3 玉米ZmPIFs基因家族成员在玉米不同发育时期表达差异的检测

3.2.4 玉米ZmPIFs基因家族成员的表达对遮阴处理的响应

3.3 玉米ZmPIFs基因在拟南芥中的功能验证

3.3.1 玉米ZmPIFs基因家族成员的基因克隆

3.3.2 玉米ZmPIFs基因表达的可变剪切模式

3.3.3 bHLH44转基因拟南芥植株的下胚轴长度测定

3.3.4 bHLH44转基因拟南芥植株的子叶张开角度测定

3.3.5 bHLH44转基因拟南芥植株的向重力性测定

3.3.6 bHLH44转基因拟南芥植株的淀粉含量测定

4讨论

（1）玉米ZmPIFs基因家族成员的结构分析与功能预测

（2）玉米ZmPIFs基因家族成员的时空表达特异性

（3）玉米ZmPIFs基因家族成员bHLH44抑制了光形态建成作用

（4）玉米ZmPIFs基因家族成员bHLH44抑制重力平衡石向白色体的转换

5结论

参考文献

致谢