检测新型鸭源鹅细小病毒的半套式PCR方法的建立及应用

摘要

鹅细小病毒（Goose parvovirus,GPV）属于细小病毒科成员之一，能够引起雏鹅和雏番鸭发病，并以小肠粘膜表层坏死脱落能形成小肠栓塞为主要特征。自2015年以来，国内不断有报道称樱桃谷鸭、北京鸭爆发了一种以短喙长舌为特征性症状的疾病（Duck Beak Atrophy and Dyndrome Syndrome,BADS）。经Chen等人的分离鉴定，确定为新的鸭源鹅细小病毒（Novel Goose Parvovirus,NGPV），本研究的目的是建立检测新型鸭源鹅细小病毒（NGPV）的半套式PCR方法，用该方法对山东、江苏两地进行了NGPV的流行情况调查的，并对分离的其中2株NGPV进行全基因组测序及同源性和进化树的分析。
　　1.山东、江苏两地送检病料的初步检测
　　根据GeneBank已公布的GPV数据，用DNASTAR.Lasergene.v7.1软件设计了GPV的PCR检测引物。对山东、江苏两地8个发病鸭群120只发病鸭分别提取心、肝、脾、肺、肾、胸腺、法氏囊、胰腺、脑、胆汁10个脏器组织DNA，共计1200个样进行初步的PCR检测，对引物的特异性进行分析，并统计每个鸭群及各个内脏的检出率。结果显示用该方法检测，每个群的最高检出率为86.7％，最低检出率为66.7%，平均检出率为75.8%,除了脑没检出病毒核酸外，其他脏器中病毒核酸检出率最高为肝脏（62.6%），最低为肺脏（9.9%），平均检出率为34.5%。
　　2.检测新型鸭源鹅细小病毒半套式PCR方法的建立与应用
　　根据GeneBank已公布的12株GPV、2株 NGPV的序列比对结果，用DNASTAR.Lasergene.v7.1软件在检测设计引物的基础上设计了检测NGPV的半套式PCR外侧引物。GPV-A-F和GPV-A-R能扩增出NGPV长度为779bp的目的基因,同时NGPV-B-R与GPV-A-F组合能够扩出NGPV长度为148bp的目的基因，而扩不出小鹅瘟疫苗的目的基因。最佳条件探索结果：当退火温度为58℃，Mg2+浓度为1.5mM（1.5μL），模板加1μL，引物各加1μL（1pM），31个循环时，效率最高。用建立的半套式PCR方法对病料检测，特异性很好，对1型鸭圆环（DuCV-1）、2型鸭圆环病毒（DuCV-2）、鸭瘟病毒(DVE)、大肠杆菌（E.coli）、沙门氏菌（SE）、鸭疫里默氏杆菌（Ra）5种常见鸭病显示阴性，灵敏性好，最低可以检出100拷贝NGPV病毒核酸。
　　应用建立的半套式PCR方法对前面普通PCR检测的样品进行复检，统计每个鸭群和10个内脏共计1200个样的检出率，并与普通PCR方法获得的数据进行比较分析。结果发现用建立的半套式PCR检测，对鹅细小检测阳性的病料进行检测，每个鸭群的最高检出率为93.3%，最低为73.3%，平均为80.8%,除了脑没检出病毒外，其他脏器的检出率最高为肝脏（93.8%），最低检出率为肺脏（23.7%），平均检出率为55.8%，与普通PCR相比明显提高了检出率。流行情况调查表明，山东、江苏2个地方的NGPV感染情况比较严重，应该引起重视。
　　3.SD-01株和SD-02株NGPV的全基因组测序及系统进化分析
　　根据GeneBank已公布的12株GPV和2株NGPV序列，用DNASTAR.Lasergene.v7.1软件设计了5对扩增NGPV的全基因组序列的引物，对分离的NGPV SD-01和SD-02毒株进行分段扩增并测序，拼接后获得2株NGPV的全基因组序列，并与其他GPV和NGPV全基因组序列进行同源性分析和进化树构建。SD-01和SD-02的全基因组与其他的12株GPV同源性在92.2～97.0%，而与sdlc01和QH15的同源性99.1～99.6%之间，与MDPV-FM的同源性分别为80.9%和81.1%,进化树分析发现2株NGPV属于GPV这一大分支，与 sdlc01株和QH15株在同一个小的分支上；对SD-01和SD-02的VP3基因与12株GPV的同源性分析，发现VP3与GDaGPV的同源性最低为93.0%，与82-032v最高为98.3%，SD-01与 sdlc01株和QH15株同源性均为99.8%，而与FM株的同源性仅为81.5%；对SD-01和SD-02的VP3编码的氨基酸同源性分析，与FM株的同源性最低分别为91.0%和90.8%，与GDaGPV同源性最低分别为96.6%和96.4%，SD-01与B株、VG321株的同源性最高，均为98.7%，SD-01与NGPV的sdlc01株和QH15株相比同源性分别为100%和99.6%，SD-02和sdlc01和QH15相比分别为99.8%和99.4%。进化树的分析显示，SD-01、SD-02与FM在不同的大分支上，和sdlc01和QH15分布在同一个小分支上，而与传统的GPV毒株相对距离较远。

目录

声明

符号说明

1 文献综述

1.1 鹅细小病毒简介

1.2 鹅细小病毒的病原学研究进展

1.3 GPV的分子生物学特征

1.4 GPV的基因编码蛋白

1.5 鹅细小病毒的流行病学

1.6 GPV的致病机理

1.7 临床症状及病理变化

1.8 GPV的诊断方法

1.9 鹅细小病毒疫苗研究进展

1.10 小鹅瘟的防治

1.11 本研究的目的意义

2 材料和方法

2.1 材料

2.2 方法

3 结果

3.1 送检病料的普通PCR方法检测

3.2 半套式PCR方法的建立

3.3 半套式PCR在NGPV检测中的应用

3.4 SD-01和SD-02 2株NGPV全基因组测序

4 讨论

4.1检测新型鸭源鹅细小病毒的半套式PCR方法的优点

4.2 NGPV的组织嗜性的分析

4.3 山东、江苏两地的新型鸭源鹅细小病毒的流行情况调查

4.4 SD-01和SD-02 2株NGPV同源性分析

5 结论

参考文献

致谢