S-亚硝基化对冷藏桃果实线粒体氧化应激的调控作用

摘要

一氧化氮（NO）自由基是生物体内一种重要的气体信号分子，参与植物的多种生理过程。为了深入研究NO在果实线粒体中的氧化还原机制以及NO处理延缓冷藏果实的衰老机制，本文研究了 NO对桃果实抗坏血酸-谷胱甘肽（AsA-GSH）循环系统的影响，探讨了桃果实中硫氧还蛋白（Trx）的表达以及 NO处理对桃果实中 Trx基因表达量的影响，并利用表面等离子共振（SPR）技术检测了桃果实线粒体中的巯基亚硝基化蛋白。
　　以肥城桃果实为实验材料，分别用NO溶液（10μmol L?1）以及 c-PTIO溶液（5μmol L-1）处理桃果实，并于0℃冷藏，研究了 NO对冷藏肥城桃果实抗氧化系统调控作用。研究结果表明，桃果实中丙二醛（MDA）的含量第二周仅为对照的51％。DPPH?自由基清除活性和GR分别为对照的1.3倍和1.7倍。外源 NO处理的桃果实在贮存期间提高了 AsA/DHA比值。AsA/DHA比值在第一周、第二周和第三周分别为对照的4.4、3.8和3.3倍。NO可以延缓桃果实中丙二醛（MDA）、总抗坏血酸和还原型抗坏血酸（AsA）含量增加。总谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽含量在贮存第二周后明显增加。DPPH自由基清除活性、DHAR和GT活性第一周低于对照，第二周高于对照。外源NO处理的桃果实第二周抑制MDHAR活性，增强GR活性。结果表明，NO处理促进桃果实AsA-GSH循环系统再生机制，有助于延缓冷藏桃果实衰老期。
　　根据 NCBI已公布的全长设计 Trx引物，从肥城桃中提取 RNA，反转录得到肥城桃Trx基因cDNA，经转染并表达纯化得到重组蛋白。cDNA全长为664 bp，目的基因长度为459 bp，共编码氨基酸153个。荧光定量 PCR表明，NO处理后的果实中 Trx表达量高于对照，且在处理的第二周表达量最大。通过研究发现，外源 NO可以通过调节肥城桃果实基因表达量来延长肥城桃的贮藏期。
　　利用原子力显微镜以及电化学方法表征了 SPR传感器自组装分子膜的形成。基于链霉亲和素和生物素特异性结合，生物素能标记蛋白巯基等特点，运用SPR技术检测了牛血清白蛋白（BSA）亚硝基化前后变化情况以及桃果实线粒体中的巯基亚硝基化蛋白。实验结果表明90.61%亚硝基化的BSA可以被还原，说明巯基亚硝基化是可逆性反应。实际样品检测表明，15μmol L-1 NO处理桃果实引起的SPR波数变化最大，30μmol L-1 NO处理桃果实引起的SPR波数变化降低，说明高浓度的NO可能抑制线粒体蛋白巯基亚硝基化程度，这为以后进一步探讨蛋白巯基亚硝基化奠定了基础。

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1引言

1.1 一氧化氮

1.2 蛋白质巯基的亚硝基化

1.3表面等离子体共振技术（SPR）

1.4 硫氧还蛋白

1.5 ROS与植物抗氧化系统

1.6研究内容及意义

2材料与方法

2.1实验材料

2.2实验仪器与试剂

2.3实验所用溶液配制

2.4 SPR传感器表征

2.5 Trx全长以及cDNA克隆

2.6 Trx基因表达量的检测

2.7生物素转换法检测巯基亚硝基化蛋白

2.8 NO对冷藏桃果实抗氧化系统的调控作用

3结果与分析

3.1 SPR传感器的表征及分析应用

3.2 Trx全长以及cDNA克隆

3.3荧光定量PCR

3.4 NO与Trx的相互作用

3.5生物素转换法检测巯基亚硝基化蛋白

3.6 NO对冷藏桃果实抗氧化系统的调控作用

4讨论

4.1 SPR检测蛋白巯基亚硝基化

4.2 Trx表达及NO对Trx基因表达的影响

4.3 NO对桃果实脂质过氧化和抗氧化系统的影响

5结论

创新之处

参考文献

致谢

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