活禽市场PM2.5微生物气溶胶监测及其对小鼠肺部损伤与诱导免疫反应

摘要

气溶胶（aerosols）指的是固态的或者液态的微粒悬浮于气体介质中所形成的分散体系。微生物以单细胞的悬浮状态、与干燥的固体颗粒和液体微粒相连而在空气中悬浮形成的生物气溶胶，也称为微生物气溶胶（Microbiological aerosol）。微生物气溶胶可以通过皮肤损伤、黏膜、呼吸道及消化道等侵入机体，在微生物气溶胶中某些致病性微生物的存在（如：不动杆菌、金黄色葡萄球菌、曲霉菌、禽流感病毒等）是导致空气污染，引起动物和人类发病的重要原因。人们通常把空气动力学直径≤2.5μm的微粒称为PM2.5。空气动力学直径≤2.5μm的微生物气溶胶是PM2.5的重要组成部分。大量的流行病学和毒理学研究表明，PM2.5能够导致机体呼吸系统、免疫系统和循环系统的损害，引发呼吸系统、心脑血管系统的疾病，从而增加死亡率。多年来，国内外有关PM2.5的研究重点放在其物理性质和化学成分，以及对机体致病机制的研究上，尚少见对PM2.5的生物成分及其危害的研究。
　　活禽市场往往建在人口密集的地区。空气中存在着大量的微生物气溶胶（细菌、真菌和病毒等），尤其是PM2.5中的微生物成分能够对短期或长期暴露在活禽市场环境中的人或动物健康产生危害。基于此，我们率先在活禽市场进行为期一年的微生物气溶胶PM2.5的监测，初步研究了活禽市场环境PM2.5气溶胶微生物成分的监测；在此基础上，为了揭示其对动物和人的危害机制，评估其风险，我们进行了不同粒径气溶胶及微生物成分致小鼠肺部损伤及其引起肺部免疫炎性反应与蛋白组变化的研究。
　　本研究分以下五部分内容：
　　1.活禽市场环境PM2.5中细菌多样性及全年动态变化规律
　　利用16S rDNA高通量测序技术，对全年活禽市场环境PM2.5中的细菌检测发现，PM2.5中的细菌在生物成分中占42.29％，其种类丰富，其中最高值出现在2014年8月的PM2.5样品中，达到了1295种细菌；最低值出现在2014年10月，为614种细菌。全年活禽市场PM2.5中的细菌种类在614~1295之间，致病性或条件致病性细菌约占总细菌种类的9.45%~18.34%。其中，作为条件性致病菌的不动杆菌（Acinetobacter）在四月（占7.90%）、六月（占4.80%）、七月（占28.62%）、八月（占26.08%）、九月（占20.71%）、十月（占13.83%）和十一月（占1.41%）的PM2.5中均能够检测到，其相对丰度占PM2.5样品中总细菌数的1.41%~28.62%；棒状杆菌（Corynebacterium）在活禽市场环境PM2.5中全年均能够检测到，其相对丰度占PM2.5中总细菌种类的2.93%~17.59%，且在七月份的PM2.5样品中所占比例达到了总细菌种类的17.59%。
　　2.活禽市场环境PM2.5中真菌多样性及全年动态变化规律
　　利用ITS高通量测序技术，对全年活禽市场环境PM2.5中的真菌检测发现，PM2.5中的真菌在生物成分中占53.68%，其种类也非常丰富，其中最高值出现在2014年8月的PM2.5样品中，达到了1437种真菌；最低值出现在2015年4月，为777种真菌。全年活禽市场PM2.5中的真菌种类在777~1437之间，致病性或条件致病性真菌约占总真菌种类的6.85%~10.31%。其中，曲霉菌（Aspergillus）全年均能检测到，其相对丰度占PM2.5样品中总真菌数的2.09%~10.02%，且在2015年4月份的PM2.5样品中占很大比例，达到了10.02%；毛孢子菌（Trichosporon）全年均能检测到，其相对丰度占PM2.5样品中总真菌数的0.05%~13.11%，且在七月（4.57%）、八月（13.11%）、九月（6.29%）和十月（7.09%）的PM2.5样品中占很大比例。
　　3.气载H5亚型AIV real-time RT-PCR方法的建立及应用
　　为了及时准确地对活禽市场环境全年PM2.5中的H5亚型AIV的含量予以监测，本研究针对H5基因的保守区设计了特异性的引物和探针，建立了检测环境中气载H5亚型AIV的荧光定量RT-PCR的方法并成功的用于活禽市场环境的检测。
　　在本研究中，全年活禽市场环境PM2.5中气载H5 AIV的平均浓度（C）在0~1.47×104 copies/m3 air之间。其中冬季和春季PM2.5中H5 AIV的浓度较高，在2014年12月PM2.5中气载H5 AIV的平均浓度（C）达到了最高值为1.47×104 copies/m3 air，且阳性率为33%；冬季和春季PM2.5中气载H5 AIV的平均浓度在6.85×101~1.47×104 copies/m3 air之间，且阳性率在16.67%~50%之间。夏季和秋季PM2.5中气载H5 AIV的浓度较低且阳性率较小。仅在2014年6月（平均浓度为6.14×101 copies/m3 air，阳性率为33.33%）和8月（平均浓度（C）为4.24×101 copies/m3 air，阳性率为16.67%）的空气样品中检出H5 AIV。
　　4.活禽市场环境不同粒径气溶胶检测及其成分（PM2.5+，PM2.5-，PM10+，PM10-）引起小鼠肺损伤的研究
　　4.1活禽市场环境PM2.5和PM10中细菌的多样性和相对丰度
　　本试验利用16S rDNA高通量测序技术对PM2.5中的细菌气溶胶进行检测，我们发现，PM2.5中的细菌气溶胶的种类和相对含量非常丰富。其相对丰度排名前二十位的细菌种属中有很多能够对人体健康造成潜在的威胁。其中，不动杆菌（Acinetobacter）占26.18%，棒状杆菌（Corynebacterium）占21.07%，肠球菌（Enterococcus）占6.85%，产气单胞菌（Aeromonas）占1.58%和假单胞菌（Pseudomonas）占0.89%是致病菌或条件性致病菌，在一定条件下可能会对人类健康有潜在威胁，特别是长期生活在活禽市场环境下的工作人员，易感人群，老人和儿童等。
　　对于PM10中的细菌气溶胶进行检测，同样，PM10中的细菌气溶胶的种类和相对含量也非常丰富。其中，不动杆菌（Acinetobacter）占24.84%，肠球菌（Enterococcus）占20.65%，棒状杆菌（Corynebacterium）占7.86%，葡萄球菌（Staphylococcus）占1.07%，弧菌（Vibrio）占0.06%和奈瑟氏菌（Neisseria）占0.06%是致病菌或条件性致病菌，在一定条件下可能会对人类健康产生潜在威胁。
　　4.2活禽市场环境PM2.5和PM10中真菌的多样性和相对丰度
　　本试验利用ITS高通量测序技术对PM2.5中的真菌气溶胶进行检测，我们发现，PM2.5中的真菌气溶胶的种类和相对含量非常丰富。其相对丰度排名前二十位的真菌种属中有很多能够对人体健康造成潜在的威胁。其中，枝孢菌（Cladosporium）占8.37%，曲霉菌（Aspergillus）占7.18%，毛孢子菌（Trichosporon）占4.94%，镰刀菌（Fusarium）占3.84%和隐球菌（Cryptococcus）占0.01%等被认为是对人类健康有潜在危害的致病性或条件致病性真菌。
　　对于PM10中的真菌气溶胶进行检测，我们发现，PM10中的真菌气溶胶的种类和相对含量也同样非常丰富。其中，曲霉菌（Aspergillus）占6.41%，镰刀菌（Fusarium）占0.08%，毛孢子菌（Trichosporon）占0.03%和端胞菌（Trichothecium）占0.01%等被认为是对人类健康有潜在危害的致病性或条件致病性真菌。
　　4.3不同粒径气溶胶成分（PM2.5+，PM2.5-，PM10+，PM10-）单一刺激小鼠引起的肺损伤（急性感染试验）
　　在急性感染试验中，小鼠肺脏组织中TLR2、TLR3、TLR4和TLR7的表达量与对照组相比升高明显。其中，TLR2、TLR4受体在所有四组不同粒径气溶胶感染组中的表达量均有升高且与对照组相比差异显著（P<0.05），另外其在PM10+感染组和PM2.5+感染组的表达量显著高于PM10-感染组和PM2.5-感染组（P<0.05）；TLR3和TLR7受体在PM10-感染组和PM2.5-感染组的表达量与对照组相比变化不明显，然而在PM10+感染组和PM2.5+感染组的表达量显著高于对照组且差异显著（P<0.05）。由此可以看出，TLR2和TLR4受体在识别病原体过程中发挥了重要的作用并且PM2.5和PM10中的微生物成分能够加重小鼠的肺部损伤程度。这一点从小鼠肺脏病例组织切片的结果中也可以看出。对于细胞因子和趋化因子来说，在急性感染试验中，起主要效应的细胞因子和趋化因子为IL-1β，TNF-α，IL-8，IP-10和MCP-1。
　　4.4不同粒径气溶胶成分（PM2.5+，PM2.5-，PM10+，PM10-）重复刺激小鼠引起的肺损伤（慢性感染试验）
　　在慢性感染试验中，TLR2和TLR4在4组感染组小鼠肺部的表达量均比对照组显著上升（P<0.05）并且高于急性感染试验中的表达量且与急性感染试验中TLR2和TLR4的表达趋势一样。对于细胞因子和趋化因子来讲，在小鼠肺损伤慢性感染模型中，IL-1β，TNF-α，IL-8，IP-10，IFN-γ，MIP-1α和MCP-1是促炎症反应的主要效应因子。通过小鼠肺脏病例组织切片结果可以发现，在慢性感染试验中，含有微生物成分的PM2.5组对机体肺损伤的程度要远高于其他组。这一方面说明PM2.5和PM10中的微生物成分在引起小鼠肺损伤的过程中起到了重要的促进作用，另一方面说明PM2.5的危害要远大于PM10对机体的危害。
　　总之，本研究提供了不同粒径气溶胶及其微生物成分感染小鼠肺组织后的免疫应答相关数据，为进一步了解不同粒径气溶胶及其微生物成分对哺乳动物宿主的感染特性奠定了基础。
　　5. PM2.5感染小鼠肺脏的差异蛋白质组研究
　　本研究对PM2.5感染小鼠72 h后取肺脏进行二维电泳分析，与对照组相比，质谱分析共鉴定了45个差异蛋白。其中上调蛋白30个，下调蛋白15个。这些蛋白与颗粒物PM2.5-宿主的相互作用有关，功能主要涉及抗氧化反应、应激反应、内分泌紊乱、组织损伤和异常、免疫反应等。例如，对于上调蛋白来说，Galectin-1具有参与机体的抗炎进程并能够抑制机体微生物的感染，激活NF-kappaB信号通路，使T细胞聚集等功能。serum amyloid A，partial是急性期感染的主要蛋白，参与机体的急性炎症反应过程。Peroxiredoxin-2参与机体抗氧化反应并针对磷酸酯多糖起防御效应。Solution Structure Of Coactosin-Like Protein针对真菌起到防御效应等。对于下调蛋白来说，Pulmonary surfactant-associated protein A参与气体的交换过程。beta-2-globin，partial参与氧气的转运过程。Apoa1 protein能够抑制参与炎症反应的细胞因子的释放。Annexin A4抑制IL-8的分泌并抑制NF-kappaB信号通路的激活等。本研究为进一步了解PM2.5对哺乳动物肺部的感染机制奠定了基础，为新型药物的研制及其新的药物靶标提供思路。