茄子花青素生物合成关键MYB转录因子的筛选及克隆

摘要

R2R3MYB转录因子（MYB transcription factor）是植物转录调控因子中最大的家族之一。R2R3MYB转录调控因子在植物的生长发育、次生代谢及非生物胁迫等生物过程中发挥重要作用。随多种植物全基因组测序的完成，多个物种的R2R3MYB家族已经被鉴别出来。目前，对于R2R3MYB转录因子在花青素生物合成过程中的功能研究，大多集中在拟南芥、水稻、大豆等模式植物中，在茄子中研究相对较少。茄皮具有紫色、白色、红色和橙色等明显的颜色农艺性状，为研究花青素的生物合成提供了基础。茄子基因组测序的完成，为茄子R2R3MYB家族的鉴定和花青素生物合成相关R2R3MYB基因的挖掘提供了有力条件。本文利用生物信息学方法对茄子R2R3MYB转录因子家族进行了鉴别，并结合茄皮转录组数据分析，筛选并克隆了一个与花青素生物合成相关的基因SmMYB6，为茄子遗传改良和创造高花青素含量的茄子新种质奠定理论基础。
　　本研究主要内容包括：⑴利用126个拟南芥R2R3MYB蛋白序列及隐马尔科夫模型（Hidden Markow Model）的识别技术，在茄子基因网站（http://eggplant.kazusa.or.jp/）中筛选出73个茄子R2R3MYB基因。⑵为了对茄子R2R3MYB全基因家族进行研究，分析了茄子R2R3MYB全基因家族与拟南芥R2R3MYB蛋白系统进化情况；茄子与拟南芥、番茄、黄瓜、水稻、大豆、杨树、葡萄和苹果R2R3MYB蛋白序列系统进化情况；N端R2R3功能域的保守性及茄子 R2R3MYB基因内含子和外显子的结构特征。⑶为了研究茄子 R2R3MYB基因在花青素生物合成中的调控作用，从73个R2R3MYB基因中筛选出9个与花青素生物合成相关的茄子R2R3MYB基因，利用qRT-PCR对其在光质处理下及不同茄子组织中的表达模式进行了分析。结果表明，LED红蓝组合1:1处理下，SmMYB4、SmMYB6、SmMYB13、SmMYB21和SmMYB22的相对表达水平比单独LED蓝光或红光处理下有所升高，且 SmMYB2、SmMYB6、SmMYB13和SmMYB22在红蓝组合光1:1处理下，其表达量高于LED白光处理，SmMYB13和SmMYB22与LED白光处理差异显著。通过分析这些基因茄子不同颜色组织中的表达模式发现，与白皮茄子相比，紫皮茄子茎、叶、花瓣和茄皮中SmMYB6表达量显著升高，而花萼中SmMYB4、果肉和茄皮中SmMYB1和SmMYB13的表达量也显著升高。以上结果表明SmMYB6在紫色组织中表达量较高。⑷利用Illumina高通量测序技术对紫色茄皮和白色茄皮的转录组进行测序，通过基因组对比及组装，得到89823条转录本，其中已知转录本86095条，新转录本3728条。⑸对转录本中的表达差异基因进行统计，并对差异表达进行GO、KEGG功能富集和InterProScan功能注释。在GO分类体系中，475条基因归为参与生物学过程，496条基因归为分子功能，246条基因归为细胞组分。KEGG通路中共有45个基因与6条类黄酮生物合成途径相关。⑹通过分析转录组数据，筛选到与茄子花青素生物合成相关MYB转录因子3个和结构基因8个。利用qRT-PCR进一步分析可知，SmMYB6在紫色茄皮中的表达显著高于SmMYB10和SmMYB18；结构基因SmF3'5'H、SmDFR、SmF3GT、Sm5GT在紫色茄皮中表达量较高。综合生物信息学和转录组数据可知，SmMYB6是参与茄子花青素生物合成的关键转录因子。⑺克隆到SmMYB6 CDS全长771 bp；并利用一步法将SmMYB6 CDS连接到植物表达载体pRII和瞬时表达载体IL-60上，成功构建了pRII-SmMYB6（+）表达载体和IL-60-SmMYB6（+）瞬时表达载体。

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1.前言

1.1植物花青素的基本结构及分类

1.2花青素生物合成途径

1.3花青素合成途径中的关键结构基因

1.4参与花青素生物合成的转录调控因子MYB

1.5本研究的目的及意义

2材料与方法

2.1试验材料

2.2试验处理

2.3测定项目与方法

2.4 数据统计与分析

3结果与分析

3.1茄子R2R3MYB转录因子的信息学分析

3.2不同茄皮组织中的转录组数据分析

3.3 SmMYB6的克隆和表达载体的构建

4讨论

4.1茄子R2R3MYB家族的信息学分析

4.2 茄皮转录组数据分析

4.3 SmMYB6的克隆和表达载体的构建

5结论

参考文献

附录

致谢

攻读硕士期间发表论文情况