KOr-NTSR1异源二聚化对KOR信号转导的影响

摘要

Kappa型阿片受体(KOR)及其内源性配体强啡肽(dynorphin)广泛分布于中枢神经系统，KOR结合配体后，经典的G蛋白通路的活化与KOR镇痛功能的实现密切相关，而非G蛋白依赖性通路的激活，尤其是β-arrestin依赖的信号通路活性的明显增强，往往直接引发KOR相关的负性情绪的出现。多项研究表明，在强迫行为以及习惯行为的养成方面有着重要作用的纹状体，KOR及其配体dynorphin的显著上调已被公认为是药物成瘾的明显标志，并且上调的KOR/dynorphin系统偏向性选择β-arrestin2依赖的信号通路，参与药物滥用以及药物成瘾的形成。因此，探寻纹状体内KOR激活后偏向性选择β-arrestin依赖的通路进行信号转导的根本原因，显然成为阐明药物滥用及成瘾机制研究中亟待解决的关键问题。
　　利用免疫荧光染色结合原位邻位连接技术(PLA)，我们不仅发现KOR及NTSR1共定位于体外培养的纹状体神经元，并且初步鉴定KOR-NTSR1异源二聚体的内源性表达。本实验拟在前期工作的基础上，进一步确认KOR与NTSR1之间的异源二聚化相互作用关系，并对KOR-NTSR1异源二聚体对KOR介导的信号转导的可能影响进行了研究:
　　(1)通过构建多种KOR、NTSR1融合表达载体，瞬时或稳定转染HEK293细胞，建立KOR和/或NTSR1表达的HEK293细胞模型。免疫印迹分析、细胞膜表面蛋白ELISA检测显示，各受体单表达组与共表达组细胞之间，受体表达量无明显差异;同时，免疫荧光染色结合共聚焦扫描观察，发现KOR、NTSR1主要定位于细胞膜上，表达均匀。提示，细胞模型构建正确，KOR、NTSR1融合表达载体表达稳定。
　　(2)通过SOE-PCR技术，对KOR TM4区域184以及196位氨基酸进行点突变，将上述位点亮氨酸突变成丙氨酸。成功构建KOR184、KOR196突变体后，瞬时或稳定转染HEK293细胞，建立KOR184/196和/或NTSR1表达的HEK293细胞模型。通过免疫印迹分析、细胞膜表面蛋白ELISA检测显示，各单表达与共表达组细胞内，KOR184/196的受体表达量与野生型KORWT相比较，无明显差异;免疫荧光染色结合共聚焦扫描显示，各单表达与共表达组细胞内，KOR184/196主要定位于细胞膜上，表达均匀稳定，与KORWT类似。
　　(3)经BRET、FRET、CO-IP分析，发现KORWT、KOR184能与NTSR1发生异源二聚化，但KOR196与NTSR1无异源二聚化相互作用，提示:KOR的196位亮氨酸是KOR-NTSR1异源二聚体形成的关键位点;同时，KOR196与NTSR1共表达的细胞，可以作为异源二聚化结合的阴性对照，应用于KOR-NTSR1异源二聚体信号转导机制的实验研究。
　　(4)通过细胞内cAMP水平的分析发现，在KOR、KOR184、KOR196独立表达组，给予dynophin A(1-13)刺激，FSK诱导的cAMP生成均受到明显的抑制:KORWT:最大抑制率=66.5％;KOR184:最大抑制率=70％;KOR196:最大抑制率=63.9％。但在KORWT/NTSR1和KOR184/NTSR1共表达细胞内，dynophin A(1-13)仅引起细胞内cAMP水平轻微下降:KORWT:最大抑制率=14.7％;KOR184:最大抑制率=14.9％，而在KOR196/NTSR1组，cAMP水平与KOR196独立表达组相近。实验表明，异源二聚化结合NTSR1之后，dynorphin A(1-13)激活KOR后，对腺苷酸环化酶的抑制作用明显减弱。
　　(5)为了验证cAMP结果，我们通过eBRET动态监测，对KOR偶联Gi蛋白的能力进行了分析。结果发现，KORWT/NTSR1和KOR184/NTSR1共表达细胞内，给予dynophinA(1-13)刺激时，KORWT/184与Gi蛋白的结合峰值明显低于KORWT/184独立表达组，而KOR196/NTSR1共表达组内，KOR196与Gi蛋白的结合与KOR196独立表达组相似。提示，异源二聚化结合NTSR1后，给予dynorphin A(1-13)时，KOR WT/184偶联Gi蛋白的能力明显下降。
　　(6)结合BRET1和eBRET检测发现，异源二聚化结合NTSR1之后，dynorphinA(1-13)刺激下，KOR WT/184与β-arrestin1/2的结合峰值明显高于KOR WT/184独立表达组，说明KOR WT/184募集β-arrestin1/2的能力明显增强，表现出明显的剂量依赖性以及时程上的延长:KOR WT/184与NTSR1共表达组，KOR WT/184与β-arrestin1/2的结合可延续到给药2h，而KOR WT/184独立表达组，仅维持到30min左右。
　　(7)对ERK1/2磷酸化水平进行免疫印迹分析发现，异源二聚化结合NTSR1之后，dynorphin A(1-13)刺激下，KORWT/184介导的ERK1/2磷酸化表现出明显的时程上的改变，出现给药15min之后的持续性ERK1/2活化，且该持续性的ERK1/2磷酸化(30min)表现出明显的剂量依赖性。KOR196与NTSR1共表达组，未观察到与KOR196独立表达组存在ERK1/2磷酸化在时程上的差异。
　　(8)为了探究KOR-NTSR1所介导的持续性的ERK1/2磷酸化的诱因，我们进一步进行了β-arrestin1/2shRNA以及PTX干预实验。β-arrestin1/2shRNA分析发现，虽然β-arrestin2几乎不参加dynorphin A(1-13)激活KORWT单体后ERK1/2的磷酸化，但是，在KORWT和NTSR1共表达的HEK293细胞，在转染β-arrestin2shRNA后，本来在30min时间点出现的较强的ERK1/2的磷酸化几乎完全消失，甚至在5min时间点的早期磷酸化也受到明显的影响，与转染control shRNA的同组细胞于相同的时间点相比较，表现出明显的削弱。通过Gi/o蛋白的选择性抑制剂PTX干预实验发现，KORWT独立表达组，PTX预孵育后，dynorphin A(1-13)诱导的早期快速磷酸化（5min时间点）几乎完全消失，而在KORWT/NTSR1共表达的细胞内，PTX对dynorphin A(1-13)诱导的早期ERK1/2磷酸化抑制率仅余40％左右。β-arrestin1/2shRNA和PTX实验结果提示，与NTSR1发生异源二聚化结合后，KOR所介导的G蛋白依赖的信号转导通路的活性明显削弱，同时β-arrestin2依赖通路的活性明显增强，
　　(9)通过细胞内cAMP水平的检测以及BRET分析，对于KORWTT1/84和NTSR1共表达的细胞，NT(8-13)单独作用时，对FSK诱导的cAMP水平的升高，没有抑制作用，同时不会引起KOR WT/184偶联Gi蛋白、结合β-arrestin1/2;在给予NT(8-13)+dynorhpinA(1-13)共刺激时，KOR WT/184对cAMP生成的抑制作用、偶联Gi蛋白的能力以及募集β-arrestin1/2的能力均恢复到dynorhpin A(1-13)刺激KORWT/184独立表达组细胞的水平。即给予NT(8-13)共刺激，能有效逆转因KOR WT/184-NTSR1异源二聚体形成所致的，KOR介导的腺苷酸环化酶活性抑制作用的降低、KOR偶联Gi蛋白能力的降低以及对β-arrestin1/2募集能力的显著增强。
　　(10)结果提示，NTSR1的激活与否，是决定KOR-NTSR1异源二聚体中KOR选择G蛋白依赖性或β-arrestin2依从性信号通路的关键因素。
　　综上所述，本实验首次原代培养的纹状体神经元，证实了KOR-NTSR1异源二聚体的内源性表达，并于转染的HEK293细胞内确认了KOR与NTSR1之间的异源二聚化相互作用关系;通过观察与Gi蛋白、β-arrestin1/2结合能力、对cAMP抑制作用以及对ERK1/2活化等方面的研究发现，与NTSR1发生异源二聚化相互作用后，KOR介导的Gi依赖的通路明显减弱，同时非G蛋白依赖的通路，尤其是β-arrestin1/2依赖的信号转导明显增强。
　　实验结果充分证实了“NTSR1是纹状体内KOR的工作伙伴”的假设，本研究为纹状体内KOR偏向性选择β-arrestin依赖的通路的现象提供了坚实的实验依据，也为阐明药物滥用及成瘾的机制提供可靠的理论依据。本研究同时还发现NTSR1的激活，可以逆转基于KOR-NTSR1异源二聚化作用而发生的KOR信号通路的转换，促使KOR经由经典的Gi依赖的通路进行信号转导，该结果不仅为NT/NTSR1系统参与痛觉调制以及安定作用的实现提供了理论基础，也为充分发挥病理状态下明显上调的KOR/dynorphin系统的作用提供新的理论支持;本研究同时为药物滥用及成瘾的防治提供了新的思路，并为新型抗成瘾药物的开发提供了有效的作用靶点，具有重要的实际意义和临床应用前景。

目录

声明

符号说明

摘要

1 前言

1．1 GPCR二聚化——“革命性”的新概念

1．2 GPCR最小的功能单位——单体还是二聚体?

1．3 异源二聚体的鉴定标准

1．4 内源性受体之间相互作用的研究方法及策略

1．5 阿片系统与异源聚化系统的交集

1．6 阿片受体参与构成的异源二聚体的功能转归

1．7 阿片受体异源二聚化作用与新药的研发

1．8 KOR与NTSR1的功能相关性以及发生二聚化的可能性

1．9 本课题主要研究目的和研究内容

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 细胞、质粒及菌株

2．1．3 主要抗体(一抗)

2．1．4 实验试剂

2．1．5 主要液体配制

2．1．6 主要实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 SD大鼠纹状体神经元原代培养

2．2．2 HEK293细胞培养

2．2．3 原代培养的纹状体神经元内KOR与NTSR1表达的鉴定

2．2．4 PLA检测纹状体神经元内KOR与NTSR1之间的相互作用

2．2．5 真核表达载体的构建

2．2．6 HEK293细胞转染

2．2．7 转染HEK293细胞内受体表达的鉴定

2．2．8 免疫共沉淀检测

2．2．9 HEK293细胞内cAMP含量的检测

2．2．10 BRET检测

2．2．11 FRET检测KORs与NTSR1之间的相互作用

2．2．12 PLA检测HEK293细胞内KORs与NTSR1之间的相互作用

2．2．13 Western blot检测ERK1／2磷酸化

2．2．14 统计学分析

3 结果与分析

3．1 纹状体神经元中KOR及NTSR1的内源性表达及共定位

3．2 纹状体神经元内源性KOR-NTSR1异源二聚体的验证

3．3 重组真核表达载体的构建

3．4 KORs(野生型或突变体)和NTSR1在HEK293细胞中的表达

3．5 KOR及其突变体与NTSR1之间相互作用的检测

3．6 NTSR1与KOR异源二聚化作用对KOR介导的G蛋白信号转导的影响

3．7 KOR-NTSR1异源二聚化作用对KOR募集β-arrestin影响

3．8 KOR-NTSR1异源二聚化作用对KOR介导的ERK1／2磷酸化的影响

3．9 β-arrestin2参与KOR-NTSR1异源二聚体介导的持续性ERK1／2磷酸化

3．10 NTSR1的激活可削弱KOR-NTSR1异源二聚化相互作用

3．11 NT(8-13)对KOR-NTSR1异源二聚体介导的ERK1／2磷酸化的影响

4 讨论

4．1 196位氨基酸是KOR与NTSR1发生异源二聚化结合的关键位点

4．2 异源二聚化结合NTSR1后KOR信号通路的转归

4．3 NTSR1在KOR信号转导通路选择中的独特导向作用

4．4 KOR-NTSR1异源二聚体是否参与疼痛与成瘾的调节?

4．5 KOR-NTSR1异源二聚化研究的新方向

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的论文及成果