一氧化氮和冷信号对贮藏期间桃果实细胞膜脂过氧化及抗氧化系统的调控作用

摘要

一氧化氮（nitric oxide，NO）是一种具有生物活性的信使分子，以其脂溶性的特点能够自由地通过细胞内的膜结构，参与细胞内多种生理生化过程。低温冷害是影响植物生长发育各个阶段的重要环境因子之一，细胞膜是感受低温冷害的重要部位。NO是植物响应冷胁迫的一个重要因子，可以有效的缓解植物冷害和果实贮藏品质，但是对于果实细胞膜脂是如何感受冷藏期间的冷信号以及NO和冷信号的交互作用对细胞膜脂组分和代谢的影响以及细胞抗氧化系统发生的反应却鲜有报道。因此，研究外源NO和冷信号对细胞膜脂过氧化的影响及其作用机理，明确NO和冷信号对细胞抗氧化系统生化反应的机制，对于延缓果实冷害，保持果实品质，延长贮藏期具有重要意义。
　　本论文的实验以肥城桃果实为试材，分别用不同浓度的NO溶液（5、15、30μmol L-1）以及c-PTIO溶液（5μmol L-1）处理桃果实，分别于0℃和25℃下贮藏，研究NO和冷信号对贮藏桃果实细胞膜脂过氧化及抗氧化系统的调控作用；并通过对肥城桃Grx基因的克隆、对Grx蛋白的原核表达研究了NO与Grx蛋白的相互作用。
　　结果表明，在冷信号的诱导下，外源15μmol L-1 NO处理明显降低了细胞膜的通透性，降低了桃果实细胞丙二醛的含量，显著降低了桃果实细胞脂氧合酶活性，提高了桃果实细胞POD、APX活性，而对于桃果实细胞脯氨酸含量、SOD与CAT活性影响不大。同时，在冷信号和外源15μmol L-1 NO的诱导下，桃果实线粒体GR、APX活性明显升高，Grx含量在贮藏前期迅速增加；而冷信号诱导下 MDHAR、DHAR活性与 GSH、GSSG含量变化和室温贮藏下无显著差异。通过研究发现，外源NO可以通过调节肥城桃细胞膜脂组分及抗氧化系统的代谢来延长肥城桃的贮藏期。Genbank已公布的肥城桃线粒体Grx基因全长513 bp，共编码171个氨基酸。根据Grx基因全长设计引物，构建Grx-pET30a重组载体，导入大肠杆菌BL21进行表达，经过镍柱进行纯化，得到重组的Grx蛋白。通过Grx的荧光定量表达实验可知，15μmol L-1 NO处理的桃果实在贮藏前期明显上调了Grx基因的表达，c-PTIO处理的桃果实在贮藏前期明显下调了Grx基因的表达，而在贮藏后期这两种处理与对照无明显差异。NO与Grx蛋白作用的紫外和荧光光谱表明NO可使Grx蛋白溶液荧光强度下降，发生荧光猝灭现象，这种猝灭属于静态猝灭。通过Scatchard模型分析，NO与Grx蛋白形成1:1的复合物。

目录

声明

符 号 说 明

1 前言

1.1 植物细胞膜脂代谢

1.2 一氧化氮与细胞抗氧化系统

1.3谷氧还蛋白

1.4 研究内容及意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3 结果与分析

3.1 NO和冷信号对细胞膜脂过氧化的作用

3.2 NO和冷信号对线粒体谷氧还蛋白系统的作用

3.3谷氧还蛋白全长cDNA的克隆

3.4谷氧还蛋白序列及结构分析

3.5 谷氧还蛋白体外表达与纯化

3.6 NO与Grx的相互作用结果分析

3.7 NO对Grx基因表达量的影响

4 讨论

4.1 NO对肥城桃果实细胞膜脂过氧化的影响

4.2 NO对线粒体抗氧化系统的影响

4.3 重组Grx的表达与纯化

4.4 NO与Grx蛋白荧光性质的影响

5 结论

创新之处

参考文献

致谢

攻读学位期间论文发表情况