RNAi沉默灰飞虱传毒相关蛋白基因抗水稻条纹病毒研究

摘要

水稻是我国乃至全世界重要的粮食作物之一。灰飞虱属于同翅目飞虱科，是刺吸式口器昆虫，除直接吸食水稻韧皮部汁液危害水稻外，还能以持久性增殖的方式传播水稻条纹病毒（Rice stripe virus，RSV）和水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus， RBSDV），对水稻的生长和发育极具破坏性，给水稻生产造成重大损失。目前利用RNAi技术防控植物病毒多采用单一的策略，传统的化学防治方法对环境污染严重。因此切断病毒的介体传播，寻找高效的抗病毒新策略势在必行。
　　本研究以灰飞虱和水稻条纹病毒为研究材料，利用 RNA沉默技术对可能参与介体传毒相关蛋白基因进行功能验证；通过干扰介体传毒相关蛋白基因和病毒基因的表达，显著降低了昆虫体内和水稻中病毒的含量；培育获得具有较高抗性水平的转基因水稻新材料。在此基础上，研究不同的RNA干扰策略对病毒的防控效果，探寻高效的抗病毒策略。主要实验结果和结论如下：
　　（1）介体传毒相关蛋白基因的克隆及功能验证
　　提取灰飞虱总RNA，反转录得到cDNA，用相应的引物PCR扩增，胶回收后与克隆载体连接转入大肠杆菌 DH5α，PCR检测为阳性菌落送于测序。序列分析显示， GAPDH3全长999bp，编码332个氨基酸（GenBank登录号为KT724283.1）；RACK全长948bp，编码315个氨基酸（GenBank登录号为KT724285.1）。用体外反转录试剂盒合成这2个基因的dsRNA，参入人工饲料中（终浓度500ng/μL），饲喂2龄带RSV灰飞虱若虫。qRT-PCR结果显示，dsRNA显著降低了这2个基因在灰飞虱中的表达水平，干扰效果从第1d持续到第8d；并且能显著降低灰飞虱中病毒的含量。以上结果表明， GAPDH3和RACK基因在灰飞虱传播RSV病毒中起到了至关重要的作用。
　　（2）原核表达介体传毒相关蛋白基因及病毒基因的dsRNA防控病毒研究
　　构建了GAPDH3、RACK及RSV SP基因的单发夹和嵌合基因双发夹的原核表达载体，导入大肠杆菌M-JM109LacY菌株中，IPTG诱导表达dsRNA；提取表达的dsRNA，参入人工饲料中（终浓度500ng/μL），饲喂2龄带RSV灰飞虱若虫。qRT-PCR结果表明，各原核表达的dsRNA均能显著降低相应基因的表达水平，干扰效果从第1d持续到第8d；并且能显著降低灰飞虱中病毒的含量；共沉默介体传毒相关蛋白基因和RSV SP基因诱导表达的dsRNA干扰效果优于只沉默介体传毒相关蛋白基因或RSV SP基因诱导表达的dsRNA。在此基础上，将诱导表达的共沉默介体传毒相关蛋白基因和RSV SP 基因的dsRNA溶于TE中（终浓度500ng/μL），喷施于野生型水稻上，接种2龄带RSV灰飞虱若虫，分别于6d和8d移出灰飞虱若虫。qRT-PCR结果表明，各dsRNA均能降低水稻中病毒的含量。
　　（3）转基因水稻表达介体传毒相关蛋白基因及病毒基因的dsRNA抗病毒研究
　　构建了GAPDH3、RACK基因和RSV SP基因的嵌合双发夹植物表达载体，冻融法导入农杆菌EHA105，转化水稻品种临稻10，获得了含各载体的转基因水稻植株。转基因植株Southern blot分析结果表明，各外源基因以不同的拷贝数整合到水稻基因组中；Northern blot分析结果表明，外源基因在植株体内可正常转录为 mRNA，随后 mRNA可剪切为siRNA。待T1代转基因水稻幼苗5叶期时，以野生型临稻10作为对照，接种2龄带 RSV灰飞虱若虫，3d后移出灰飞虱若虫。3周后调查结果显示，转基因植株SP+GAPDH3对RSV的抗病率为33.33％，转基因植株SP+RACK对RSV的抗病率为50%。已有研究显示，转基因植株RSV SP对RSV的抗病率为29.41%。表明共沉默介体传毒相关蛋白基因及病毒基因的转基因水稻比只沉默病毒基因的转基因水稻具有更高的对RSV的抗病性。

目录

声明

符 号 说 明

1 前言

1.1水稻条纹病毒及其危害

1.2水稻条纹病毒传播介体及介体传毒相关蛋白

1.3 RNA沉默技术及应用

1.3.1 RNA沉默技术

1.3.2 RNA沉默技术与基因功能研究

1.3.3 RNA沉默技术与抗病毒研究

1.4本研究的目的及意义

2 材料与方法

2.1实验材料

2.1.1毒源

2.1.2供试植物与昆虫

2.1.3质粒和菌株

2.1.4序列测定

2.1.5酶和常用生化试剂

2.1.6引物

2.2方法

2.2.1目的基因的克隆

2.2.2体外转录合成dsRNA

2.2.3体外合成dsRNA饲喂灰飞虱

2.2.4 qRT-PCR检测灰飞虱体内目的基因的表达水平

2.2.5原核表达载体的构建

2.2.6 dsRNA的表达、提取和分析

2.2.7原核表达dsRNA饲喂灰飞虱

2.2.8原核表达dsRNA喷施野生型水稻

2.2.9植物表达载体的构建

2.2.10农杆菌介导的水稻转化及转基因植株的获得

2.2.11转基因植株的Southern blot分析

2.2.12转基因植株的Northern blot分析

2.2.13植株siRNA的Northern blot分析

2.2.14 T1代转基因水稻植株的RSV抗性鉴定

3 结果与分析

3.1介体传毒相关蛋白基因的克隆及功能验证

3.1.1灰飞虱GAPDH3、RACK基因的克隆

3.1.2体外转录合成dsRNA

3.1.3体外合成dsRNA喂食灰飞虱后灰飞虱体内RSV的积累量

3.2原核表达介体传毒相关蛋白基因及病毒基因的dsRNA防控病毒研究

3.2.1原核表达载体的构建

3.2.2大肠杆菌M-JM109lacY菌株的转化

3.2.3 dsRNA的诱导表达和提取

3.2.4原核表达dsRNA喂食灰飞虱后灰飞虱体内RSV的积累量

3.2.5原核表达dsRNA处理水稻后水稻中RSV的积累量

3.3转基因表达介体传毒相关蛋白基因及病毒基因的dsRNA抗病毒研究

3.3.1植物表达载体的构建

3.3.2 T0代转基因植株的获得及鉴定

3.3.3 T0代转基因植株Southern blot分析

3.3.4 T0代转基因植株Northern blot分析

3.3.5 T1代转基因水稻植株的RSV抗性鉴定

4 讨论

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的论文及成果