苹果TLP基因家族的鉴定分析和MdTLP7在非生物胁迫应答中的功能研究

摘要

TLP（Tubby-like protein）蛋白包含一个保守的tubby结构域，动物TLP基因的突变会导致一些与动物特征相关的疾病，比如肥胖、视力和听力退化等。植物中也存在编码TLP的同源基因，与动物TLP相比，植物TLP研究较少，有些TLP成员受非生物胁迫诱导，表达上调。本研究利用生物信息学方法在苹果基因组中鉴定了苹果 TLP 基因家族，并对家族成员的序列特征、启动子区域以及胁迫响应等进行了分析；对其中一个成员——MdTLP7，探究了在拟南芥中超表达后其对植物抗逆性的作用，为TLP基因家族响应胁迫功能研究奠定了基础。主要研究结果如下： （1）在苹果基因组中鉴定出9个TLP编码基因。采用本地BLAST和隐马尔可夫统计模型两种方法在苹果全基因组中查找可能的TLP编码序列，再经Interpro和SMART数据库两层筛选，最终在苹果基因组中鉴定出9个TLP编码基因，命名为MdTLP1-9， MdTLPs基因分布在苹果基因组的6条染色体上。结合其他植物TLP成员进行进化分析，结果表明TLP可以分成3组（A、B和C组），其中A组成员最多，包含4个亚组。有7个MdTLPs成员分布在A组的3个亚组，而MdTLP8和MdTLP9属于B组。MdTLPs基因结构分析表明，组内成员的外显子和内含子组成特征差别小，而组间成员的差异大。 （2）MdTLPs 家族蛋白结构域及基序特征分析。MdTLPs 除了靠近羧基端的 tubby结构域外，分布在A组的6个MdTLPs成员含有一个额外的F-box 结构域，所以这6个MdTLPs又是具有tubby结构域的F-box蛋白，F-box蛋白大家族被报道参与植物的多种生理活动。进一步分析 tubby结构域，发现 3 种保守基序（Motif），其中 Motif 1和Motif 2属于TLP蛋白的特征序列，而Motif 3首次在植物TLP成员中被鉴定。同源建模显示，MdTLPs的tubby结构域在空间结构上与动物TLP类似，羧基端形成的1段疏水α-螺旋被12片β-折叠所围绕组成的β桶状结构，有4个MdTLPs成员具有典型完整的β桶和α-螺旋，有的成员缺少α-螺旋，还有的既缺少α-螺旋β桶也不十分完整。 （3）MdTLPs家族基因表达特征分析。启动子分析表明，所有MdTLPs的启动子区域都存在一些非胁迫响应元件和转录因子结合元件，包括ABRE、DRE、LTRE、MYB和MYC等。为了进一步探究MdTLPs与胁迫应答的关系，利用qRT-PCR技术，检测了不同胁迫和外源ABA处理对MdTLPs表达的影响。大部分成员在不同胁迫下，在根和叶中的表达都有不同程度上调。PEG处理时，叶片中有的成员上调高达35倍，根中的上调倍数有的也高达30倍左右；冷处理下，几乎所有MdTLPs家族成员在根和叶中的表达都发生上调；不同 MdTLP 基因对 H2O2和ABA 处理的应答在根和叶中不同， MdTLP1-5在叶中显著上调，而根中除MdTLP4外，其他4个成员并没有显著上调，另外 3 个成员（MdTLP6、MdTLP8和MdTLP9）表达显著上调。组织表达模式表明，各MdTLP 基因在多个组织中都有表达，大部分成员在营养组织根、茎、叶中表达水平较高，在生殖组织花中相对较低。 （4）超表达MdTLP7增强了拟南芥对非生物胁迫的耐受性。利用转基因技术，在拟南芥中分别超表达MdTLP7全长（OE-FL）和tubby结构域（OE-Tub），筛选得到纯合植株。在高盐和干旱处理下对比 OE-FL、OE-Tub和野生型（WT）幼苗的生长状况，发现OE-FL和OE-Tub植株的生存率明显高于WT，说明与WT相比，OE-FL和OE-Tub植株的抗渗透胁迫明显增强；冷胁迫下，虽然 WT，OE-FL和 OE-Tub植株都能存活，但 OE-FL和OE-Tub植株生长状况要明显好于WT。说明MdTLP7基因不管是全长还是tubby结构域都能够提高植物的抗渗透胁迫能力和冷胁迫能力，并且总体看来有F-box 结构域的MdTLP7其作用更明显一些。 （5）碱性氨基酸位点（K190XR192）对 MdTLP7 的抗逆功能具有重要作用。一段保守氨基酸位点（KXR）直接影响动物TLP的功能，MdTLP7的对应位点为K190XR192，利用构建的MdTLP7原核表达质粒，单突或双突这两个碱性氨基酸编码序列，然后转入大肠杆菌。结果显示，在盐胁迫下，与空质粒相比，野生型MdTLP7明显增强了大肠杆菌的抗性，而突变体降低了MdTLP7的抗逆功能，尤其突变体MdTLP7K190E，MdTLP7R192A和MdTLP7K190E R192E显著降低了MdTLP7的抗逆功能，说明了K190XR192这两个氨基酸对于MdTLP7的抗逆功能具有重要作用。

目录

声明

符 号 说 明

1前言

1.1植物抗逆性研究进展

1.2TLP（tubby-like protein）基因家族研究进展

1.4苹果基因组学研究进展

1.5基因转录水平差异表达研究方法

1.6本研究的目的和意义

2材料与方法

2.1实验材料

2.2实验方法

3结果与分析

3.1在苹果基因组中鉴定了9个TLP编码基因

3.2 MdTLPs基因家族中鉴定出一个额外的功能结构域F-box结构域

3.3 MdTLPs基因染色体定位和基因结构

3.4 MdTLPs的保守Motif预测和同源建模及亚细胞定位预测

3.5苹果TLP基因响应非生物胁迫

3.6苹果TLP基因的组织表达模式

3.7苹果MdTLP7的抗性研究

4讨论

5结论

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表的论文及成果