辣椒溶杆菌GntR家族转录调节基因在菌株X2-3生物膜形成及抗逆性中的功能分析

摘要

辣椒溶杆菌(Lysobacter capsici)X2-3是本实验室从小麦根际土壤中分离得到的一株溶杆菌菌株,对多种植物病原真菌和卵菌具有明显的拮抗活性.该菌株菌落表面光滑,GC%含量高,具有很强的滑动性.本研究以L.capsici X2-3为出发菌株,构建了X2-3转座子随机插入突变体库,从突变体库中筛选生物膜表型变化的突变株,并对突变体MT4的相关基因功能进行了分析.取得的主要研究结果如下: 1.随机插入突变体库构建 利用Tn5随机插入法对X2-3进行转座诱变,获得了4800余个插入突变体.以生物膜表型特征为依据,筛选得到了7株生物膜表型变化的突变株,分别命名为MT1-MT7.通过质粒拯救法,确定了Tn5在不同突变体中插入的目的基因位点,其中3个突变株插入位点在同一个基因LC0409,其余4个突变体插入位点分别在基因LC3417,LC3753,LC4356和LC0306. 2.突变体MT4插入基因的功能预测 对突变株MT4插入基因在GenBank中比对分析,发现,该基因编码GntR家族转录调控因子,其氨基酸序列与辣椒溶杆菌L.capsici(ID:ALN83455)氨基酸序列相似性达到100%,与产酶溶杆菌L.enzymogenes(ID:WP_057949624)氨基酸相似性达到96%. 对MT4突变体生物学特性观测发现,MT4的生物膜产量明显低于野生株;以4种植物病原真菌为靶标,分析其拮抗活性,发现MT4的抑菌活性与野生株没有差别,说明生物膜的变化对抑菌活性没有影响. 3.回复突变体构建 提取野生株X2-3的基因组DNA,PCR法从X2-3中扩增到LC4356的完整ORF,经HindⅢ和BamHⅠ双酶切,连接到广宿主载体pBBR1MCS-5,电击法将重组质粒PBBR1-4356转入MT4突变体,经表型观察、分子生物学验证,获得回复株MCS-4356. 4.GntR家族基因LC4356对其上游基因的调节作用 荧光定量PCR法检测了野生株X2-3、突变体MT4和回复株MCS-4356中LC4356基因及其上游基因LC4357、LC4358、LC4359的表达量,结果发现MT4和MCS-4356菌株的LC4356基因及其上游基因的表达量均有明显变化. 5.突变体与野生株生物学特性分析 比较了野生株X2-3、突变体MT4及其回复株MCS-4356的生物学特性,发现,突变体的生长速度与野生株及回复株相比没有明显变化,但MT4的生物膜和胞外多糖产量均明显降低.菌落直径法测定了各菌株的运动能力,发现培养4d后,野生株、突变体及其回复株在NYGB培养基上的菌落直径分别为2.51cm,1.59cm和1.87cm,可见突变体的菌落明显小于野生株,回复株部分恢复了突变体MT4的运动能力. 6.突变体与野生株对环境的耐受性分析 从5个方面测定了突变体与野生株对环境的耐受性,结果发现,在不同NaCl浓度、pH和培养温度下,突变体MT4的生长速度与野生株没有明显的差别;但经不同浓度的SDS和紫外光处理后,突变体MT4的生长速度显著降低,表明突变体MT4对SDS和紫外光处理非常敏感,但对盐浓度、pH和培养温度等没有明显的改变.而回复株与野生株在5种条件下生长速度没有明显差别,表明回复株恢复了突变体MT4对环境的耐受性.

目录

声明

英文缩略词及中文对照表

1 前言

1.1溶杆菌的研究进展

1.1.1溶杆菌属的分类地位

1.1.2溶杆菌属的生物学特性

1.1.3辣椒溶杆菌（L. capsici）的研究进展

1.2 转座子插入突变

1.2.1转座子

1.2.2侧翼序列的获得

1.2.3转座子插入突变在细菌功能研究中的应用

1.3 细菌生物膜

1.3.1生物膜形成过程

1.3.2生物膜结构和组成

1.3.3生物膜的作用

1.4 GntR家族转录调控因子

1.4.1 GntR家族转录调控因子的特性

1.4.2 GntR家族转录调控因子的功能

1.5 本研究的目的及意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌株及质粒

2.1.2培养基

2.1.3主要实验仪器

2.1.4酶与试剂

2.1.5 引物

2.2实验方法

2.2.1 电转感受态细胞的制备及转化

2.2.2突变体的筛选及质粒拯救法鉴定侧翼序列

2.2.3突变体突变基因功能互补

2.2.4荧光定量PCR

2.2.5野生株、突变株和回复株的表型及活性分析

3 结果与分析

3.1 突变体的筛选和验证

3.1.1 突变体的筛选

3.1.2 突变体的验证

3.1.3 突变体侧翼序列的确认

3.2 突变体MT4的插入基因及生物学特性

3.2.1 LC4356基因的分析

3.2.2 突变体和野生株菌落形态的变化

3.2.3 突变体和野生株生物膜产量的变化

3.2.4 突变体和野生株抑菌活性的变化

3.3 突变体MT4突变基因互补

3.3.1 LC4356基因的PCR扩增

3.3.2重组载体的构建

3.3.3重组表达载体PBBR1-4356的酶切

3.3.4 回复菌株MCS-4356的筛选及验证

3.4 GntR对上游基因的转录调控分析

3.4.1 菌株RNA提取

3.4.2 反转录成cDNA

3.4.3 荧光定量PCR

3.5 野生株和突变株生物膜及生物学特性变化

3.5.1 GntR的突变对生长的影响

3.5.2 GntR的突变对生物膜产量的影响

3.5.3 GntR的突变对胞外多糖产量的影响

3.5.4 GntR的突变对运动性的影响

3.5.5野生株与突变株抗逆性的比较

4 讨论

4.1 EZ-Tn5随机插入突变体的筛选和侧翼序列分析

4.2 LC4356基因回复菌株的构建

4.3 突变体生物学相关特性及抗逆性的研究

4.4 GntR家族基因LC4356对其上游基因的调节作用

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间论文发表情况