辣椒溶杆菌X2-3缬氨酸-甘氨酸重复蛋白VgrG基因功能分析

摘要

生防细菌可以促进植物的生长发育、产生多种代谢产物进而发挥拮抗性或竞争性作用，抑制或杀死病原菌，是植物病害生物防治的重要资源。植物根际促生细菌（Plant Growth Promoting Bacteria,PGPB）的定殖能力、抗菌活性、环境耐受性等是其发挥作用的前提。辣椒溶杆菌X2-3是从小麦根际土壤中分离的对多种植物病原真菌和卵菌具有明显拮抗活性的菌株，具有良好的生防潜能，但目前尚未有一种适用于菌株X2-3的基因敲除技术。本研究利用自杀载体，建立了一种适用于L.capsici X2-3菌株的基因定向敲除技术，对基因VgrG进行敲除，分析了突变体在生物学特性、竞争性及环境耐受性等方面的特征，为以后深入挖掘X2-3的功能及应用奠定了基础。本研究的研究结果主要包括以下方面： 1.基因LC1470序列分析及功能预测 根据X2-3全基因组测序和功能预测结果，编号LC1470的基因可能编码VI型分泌系统Vgr家族的保守蛋白。经GenBank，Blastp对比，发现LC1470与L.antibioticus、L.capsici VgrG基因氨基酸的同源性达到了96.35%，具有高度保守性。 2.VgrG基因敲除突变体及基因互补突变株的获得 根据基因序列设计特异性引物扩增基因VgrG的同源臂，并将其与自杀载体pKMS1连接，成功构建pKMS1-VgrG敲除重组载体。电击转化野生菌株X2-3感受态细胞，经卡那霉素(Km500μg.mL-1)和10%的蔗糖平板NAS筛选，初步得到VgrG缺失突变体。经PCR和Southern blot验证，确认菌株M651为VgrG基因缺失突变株。 以野生株X2-3的基因组DNA为模板，设计特异性引物，扩增LC1470的完整ORF；经HindⅢ和BamH I双酶切后，连接到同样双酶切的广宿主载体pBBR1-MCS5。将重组质粒pBBR1-1470转入突变菌株M651的感受态，经表型观察和PCR验证，获得互补株MCS18。 3.野生株、突变体生物学特性分析 对野生株、突变体M651和互补菌株MCS18的菌落形态比较发现：野生菌株X2-3表面光滑、粘稠，而突变菌株M651表面多褶皱、粘度低，而互补株MCS18恢复了野生型菌株的形态。突变菌株M651的生长速度，在测定的各时间点均明显低于野生菌株X2-3，互补株MCS18基本恢复野生株水平，但在个别时间点上与野生株也有显著差异。 从生物膜产量、胞外多糖产量和运动能力等方面，对突变体与野生株的生物学特性进行分析。结果发现野生菌株X2-3的生物膜产量显著高于突变株M651，互补菌株MCS18的生物膜产量低于野生株，但是两者间没有显著差异。对胞外多糖测定发现，突变菌株M651的胞外多糖产量显著高于野生株和互补菌株MCS18。突变株M651的运动能力显著低于野生菌株X2-3，互补株MCS18的运动能力基本恢复到了野生株的水平，与野生株无显著性差异。平板对峙法对菌株的抑菌活性分析发现，野生菌株X2-3、突变株M651、互补株MCS18的抑菌活性没有显著的变化。 4.野生株、突变体抗逆性分析 从温度、SDS、酸碱度、盐浓度、紫外线等分析了各菌株的抗逆能力。结果发现突变菌株M651对高低温度、酸碱度、盐浓度、SDS的耐受性显著低于野生菌株，互补株MCS18与野生株的耐受性也存在一定差异，但差异并不显著。突变株M651、野生株X2-3和互补株MCS18对紫外线处理均不敏感。这些结果表明，基因VgrG不仅会影响菌株的生物学性状，还与菌株对环境的耐受性有关。 5.野生株、突变体与其它细菌的竞争能力分析 选择烟草青枯菌（Ralstonia solanacearum）、植物根际细菌（Burkholderia cenocepacia）D-7和Escherichia coli S17-1为靶标，对野生菌株X2-3、突变株M651及互补菌株MCS18的竞争能力进行分析。通过平板计数法和实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）法，分析了突变体与野生株竞争能力是否存在差异。平板计数法测定发现，突变菌株M651对R.solanacearum、E.coli S17-1和B.cenocepacia D-7竞争能力与野生株相比均有不同程度的减弱，而互补菌株MCS18的竞争能力基本恢复野生株的水平。 进一步用qRT-PCR法分析发现，与E.coli S17-1、B.cenocepacia D-7和R.solanacearum共培养后，突变菌株M651的浓度比在24h、48h分别为12.57%和13.81%、10.68%和18.27%、1.59%和2.08%，均低于野生菌株X2-3、互补菌株MCS18的比值，这表明突变菌株M651对E.coli S17-1、B.cenocepacia strain D-7、R.solanacearum的竞争作用弱于野生菌X2-3和互补菌株MCS18。

目录

声明

英文缩略词及中英文对照表

1 前言

1.1 植物病害生物防治

1.1.1 植物病害概括

1.1.2 病害生物防治

1.2 溶杆菌研究进展

1.2.1 溶杆菌分类地位

1.2.2 生物学特性

1.2.3 溶杆菌作用机制

1.2.4 溶杆菌应用现状

1.2.5 辣椒溶杆菌研究进展

1.3 细菌基因敲除研究现状

1.4 细菌分泌系统

1.4.1 T6SS系统的结构及组成

1.4.2 T6SS分泌系统的作用

1.4.3 VgrG研究进展

1.5 细菌生物膜

1.6 细菌的运动性

1.7 荧光定量PCR的应用现状

1.8 本研究的目的及意义

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 菌株、质粒及试剂盒

2.1.2 培养基组分及配方

2.1.3 生化及分子生物学试剂

2.1.4 主要实验仪器

2.1.5 引物设计及合成

2.2 试验方法

2. 2.1 细菌基因组DNA的提取

2.2.2 质粒DNA的小量提取

2.2.3 同源臂PCR扩增、纯化及TA克隆

2.2.4 热激转化

2.2.5 阳性单克隆的验证

2.2.6 阳性单克隆的酶切

2.2.7 克隆质粒的大体系酶切及回收

2.2.8 同源片段与自杀载体的酶切、连接及转化

2.2.10 感受态细胞的电击转化

2.2.11 敲除突变体的筛选

2.2.12 互补载体的构建及筛选

2.2.13 Southern Blot

2.3 菌株生物学特征分析

2.3.1 菌落形态观察

2.3.2 生物膜相对含量的测定

2.3.3 菌株胞外多糖的测定

2.3.4 菌株运动性的测定

2.3.5 生长曲线的测定

2.3.6 抑菌作用分析

2.3.7 抗逆性分析

2.4 菌株间竞争能力分析

2.4.1 平板稀释法

2.4.2 荧光定量PCR

3 结果分析

3.1 基因LC1470分析

3.2 突变体的获得

3.2.1目的基因同源臂的克隆

3.2.2 同源臂A、B片段的连接

3.2.3 AB同源片段与克隆载体连接及验证

3.2.4 AB同源片段与自杀载体pKMS1重组载体的构建

3.2.5 突变体的筛选与验证

3.2.6 Southern blot

3.3 野生株与突变体比较

3.3.1 野生株与突变体菌落形态的比较

3.3.2 野生株与突变体生物膜产量比较

3.4 互补突变株的获得

3.4.1 克隆VgrG基因

3.4.2 载体Blunt-VgrG的构建

3.4.3 pBBR1-VgrG重组载体的构建

3.4.4 互补菌株的筛选

3.5 野生株、突变株、互补株的功能分析

3.5.1 菌落形态

3.5.2 生长能力测定

3.5.3 抑菌能力

3.5.4 生物膜

3.5.5 胞外多糖

3.5.6 运动能力

3.5.7 抗逆性

3.5.8 菌株间的竞争能力

4 讨论

4.1 基因敲除体系的建立

4.2 基因VgrG的功能预测

4.3 生物学特性分析

4.4 环境耐受性分析

4.5 竞争能力分析

5 结论

参考文献

致谢

附录

攻读学位期间论文发表情况