拟南芥B类ARRs调控茎端分生组织重塑与维持的分子机理研究

摘要

茎端分生组织（shoot apical meristem，SAM）是高等植物地上部分组织和器官形成的来源。在合适的培养条件下，成熟组织能够通过形成愈伤组织进而再生茎端分生组织。茎端分生组织再生是植物进行离体快速繁殖和遗传转化的基础，也为研究干细胞维持、细胞命运决定和激素信号转导等基础科学问题提供了良好体系。研究表明细胞分裂素通过与生长素互作在茎端分生组织的重塑与维持过程中发挥了至关重要的作用。本研究以模式植物拟南芥为研究材料，通过细胞生物学、遗传学及生物化学等实验手段，深入研究了细胞分裂素 B 类响应调节因子（type-B Arabidopsis response regulators，type-B ARRs）调控茎端分生组织重塑与维持的分子机理，主要研究结果如下： （1）B类ARRs在茎端分生组织再生过程中呈现动态表达模式 分别利用 ProWUS:dsRED 与 ProARR1:ARR1-GFP、ProARR10:ARR10-GFP和ProARR12:ARR12-GFP的双标记转基因株系观察了ARR1、ARR10、ARR12与组织中心决定基因WUSCHEL（WUS）在茎端分生组织再生过程中的时空表达模式。结果显示， ARRs 的表达信号在芽诱导早期的外植体中逐渐增强并呈组成型分布；芽诱导培养第六天（shootinductionmedium 6days，SIM6D）时，ARRs的表达信号在特异区域集中，此时WUS在ARRs信号分布区域内的几个细胞中起始表达；此后，ARRs表达信号在正在形成的茎端分生组织中心区域集中，并与WUS的表达区域重叠；茎端分生组织形成后（SIM12D），ARRs信号分布在茎端分生组织的中心区域，并与WUS的表达区域存在重叠。 （2）ARR1、ARR10和ARR12在茎端分生组织形成过程中起到至关重要的作用 用乙醇诱导的人工小RNA（artificial microRNAs，am）分别在茎端分生组织再生不同阶段同时抑制ARR1、ARR10、ARR12的表达，结果表明在WUS表达之前（SIM4D）抑制B类ARRs表达显著降低芽再生频率；WUS表达之后（SIM8D和SIM12D）抑制B类 ARRs 的表达，芽再生频率与对照相似。上述结果说明 ARR1、ARR10、ARR12 在茎端分生组织重塑过程中发挥作用；茎端分生组织建成后，降低 ARR1、ARR10、ARR12的转录水平并未影响再生芽的发育。 （3）B类ARRs直接激活WUS转录 在arr1/10、arr1/12和arr10/12双突变体以及抑制ARR1、ARR10、ARR12表达的转基因植株 am-ARR1/10/12 的芽再生过程中，WUS 的转录水平均明显下降；在芽诱导过程中抑制ARR1、ARR10和ARR12表达造成gWUS-GFP3标示的WUS表达信号显著减弱。在 arr1/12 双突变体中过表达WUS 能够完全互补芽再生能力下降的表型。ChIP、EMSA、酵母单杂和瞬时激活实验均证明，B类ARRs直接结合WUS的启动子区域并激活其转录。上述结果说明ARR1、ARR10和ARR12通过直接正向调节WUS转录调控茎端分生组织再生。 （4）ARR1、ARR10和ARR12协同调控YUC1和YUC4的表达 在芽再生过程中，与野生型相比，编码生长素合成酶 YUCCA（YUC）家族基因， YUC1和YUC4，在arr1/10、arr1/12和arr10/12双突变体中的转录水平明显上升，而YUC2和YUC6的转录水平没有明显变化。ARR10与YUC4芽再生过程中表达模式分析实验发现，SIM培养早期（SIM2D和SIM4D），YUC4的分布模式与ARR10基本一致，在整个外植体均表达，且ARR10的表达信号强于YUC4。之后（SIM6D），ARR10在特定区域集中表达，YUC4表达信号在ARR10表达的区域减弱；SIM培养8D时，ARR10表达信号在即将形成的茎端分生组织的中心区域集中，而YUC4表达信号分布在ARR10表达区域两侧。在茎端分生组织形成后（SIM12D），ARR10在组织中心区域表达，YUC4则在茎端分生组织最外层细胞中表达。ARR10和ARR12突变造成YUC4与WUS的表达模式发生变化，与野生型相比YUC4表达信号增强并且不再产生区域化集中的特定分布模式，而WUS的表达信号消失。利用ProYUC1:GUS转基因株系的观察进行石蜡切片结果证明在arr双突变体中YUC1的表达也明显增强。利用生长素响应的标记植株检测发现，arr10/12双突变体中生长素响应信号增强，且信号分布模式与YUC1和YUC4在突变体中的表达模式相似。这些结果表明茎端分生组织重塑和维持过程中， ARR1、ARR10和ARR12在组织中心区域抑制YUC1和YUC4的表达，进而将YUC1和YUC4限制在周围区域表达。 （5）B类ARRs介导的YUC1和YUC4表达模式对于芽再生是必需的 过表达YUC1或YUC4均导致芽再生能力明显下降。分别利用ARR10和WUS的启动子异位表达YUC4，芽再生能力均出现明显下降，并且由 WUS 启动子驱动的异位表达造成的芽再生能力下降更加明显，说明在B类ARRs表达的范围内特别是其中的WUS 表达区域抑制YUC4的表达对于芽的再生是十分重要的。ChIP、EMSA、酵母单杂及启动子点突变实验均证明，B类ARRs对于YUC4转录的抑制是直接的。上述结果说明茎端分生组织再生需要ARR1、ARR10和ARR12对于YUCs转录的抑制作用。 （6）B类ARRs通过调控WUS转录参与茎端分生组织的维持 在体内茎端分生组织中，ARR1、ARR10和ARR12在中心区域表达，并与定位在组织中心的 WUS 重叠；而 YUC4 信号则分布在 L1 层细胞中。与野生型背景下相比， arr1/10/12三突变体中和乙醇诱导24h降低ARRs表达水平的am-ARR1/10/12株系中， WUS信号都出现明显下降。在arr10/12双突变体中，YUC4信号从L1层扩散到茎端分生组织的中心区域，而这一趋势在arr1/10/12三突变体中更为明显。半薄切片观察发现arr1/10/12三突变体及过表达YUC1或YUC4的植株中茎端分生组织明显减小，细胞数目减少。上述结果说明ARR1、ARR10和ARR12通过对WUS、YUC1和YUC4的调控作用参与了茎端分生组织维持。 综上所述，在茎端分生组织再生初期，ARR1、ARR10和ARR12与YUC1、YUC4均在外植体中呈组成型分布、表达区域重叠；随后，B类ARRs表达信号向特定区域集中。在它们的表达区域中，B类ARRs一方面通过直接结合WUS激活其转录，另一方面直接抑制生长素关键合成酶基因YUC1和YUC4的表达，阻止生长素在茎端分生组织中心区域的积累，从而间接促进WUS的表达。B类ARRs对WUS的上述双重调控在茎端分生组织的重塑和维持过程中均发挥了至关重要的作用。研究结果为理解激素调控分生组织维持的分子机理提供了信息，为促进植物离体快繁和遗传转化体系的建立奠定了理论基础。

目录

声明

符 号 说 明

1 前言

1.1植物干细胞与分生组织的发育

1.2植物器官再生

1.3细胞分裂素

1.4生长素

1.5目的意义

2材料与方法

2.1材料

2.2实验方法

3 结果与分析

3.1 B类ARRs在芽诱导形成阶段起到至关重要的作用

3.2 B类ARRs通过调控WUS的表达控制拟南芥芽的再生

3.3 B类ARRs直接激活WUS的转录

3.4 B类ARRs通过抑制YUCCAs的表达限制组织中心区域生长素的积累

3.5 B类ARRs直接抑制YUCCAs的表达

3.6 B类ARRs在植株中维持茎端分生组织发育

4 讨论

4.1 芽诱导形成阶段B类ARRs对WUS的表达具有重要的调控作用

4.2 B类ARRs介导的WUS的转录需要RE1和RE2调控因子

4.3 ARR1、ARR10和ARR12是双向转录调控因子

4.4 细胞分裂素和生长素对于茎端干细胞微环境形成的调控网络

5结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况