苹果乳胶蛋白MdMLP423响应非生物胁迫的研究

摘要

苹果是重要的经济作物，种植范围广泛，经常会遭受干旱、高盐、低温等非生物胁迫，严重影响其生长发育和产量，因而提高苹果的抗逆性显得尤为重要。利用现代生物技术研究苹果的抗逆机制、挖掘抗逆基因，对苹果产量和品质具有十分重要的意义。在本实验室前期苹果转录组研究中，发现一个在逆境胁迫下表达显著上调的基因，编码一种植物特有的乳胶蛋白（Major Latex Protein，MLP）。为了深入研究该基因对非生物胁迫的响应，我们在原核细胞中诱导表达了该蛋白，研究了其对细胞抗逆功能的影响及发挥功能的位点；利用转基因技术在拟南芥中超表达该基因，研究在植物体中的抗逆作用。主要研究结果如下： （1）MdMLP423基因的生物信息学分析。本实验室前期苹果转录组研究中发现了一个盐胁迫诱导表达上调7倍的基因，该基因在GenBank中的注册号为LOC103448744，编码的蛋白质被命名为MdMLP423，属于乳胶蛋白。该基因定位于苹果第11号染色体，编码152个氨基酸残基。SignaIP和TMHMM软件分析发现，MdMLP423蛋白无信号肽也不存在跨膜区，属于水溶性胞质蛋白。基于拟南芥 MLP（AtMLP28）同源建模可知，MdMLP423的结构与其他MLP成员相似，由7个β折叠和3个α螺旋组成，其中7片β折叠围绕羧基端一段长α螺旋（α3）构成一种Helix-grip折叠，另外结构中还形成一个疏水凹槽，与配体的结合进而发挥其生物学功能密切相关。 （2）重组表达MdMLP423 提高了原核细胞抗逆能力。将克隆得到的 MdMLP423基因构建到 pET30 原核表达载体上，转化大肠杆菌细胞，在含有盐或渗透剂的胁迫培养基上观察 MdMLP423 的表达对细胞生存能力的影响，以转化空质粒为对照。结果表明，在NaCl、KCl或甘露醇固体培养基上，重组表达MdMLP423大肠杆菌的菌落数明显多于对照空质粒；在NaCl、KCl或甘露醇液体培养基中，重组表达MdMLP423大肠杆菌的生长速度明显高于对照，比对照更早到达对数生长期，这说明 MdMLP423 明显提高了原核细胞的抗逆能力。 （3）Gly-rich loop影响 MdMLP423的抗逆功能。MLP家族成员在第一个α螺旋与第二个β折叠之间有一段无规则卷曲，该序列上都有一段富含甘氨酸（Gly）的保守序 列 （GlyxxxxxGly)， 称 为 Gly-rich loop ， MdMLP423 中 该 序 列 为Gly46Gly47Gly48xxxxGly53。Gly-rich loop 与配体结合发挥生物学功能有关。为了探究Gly-rich loop对MdMLP423功能的影响，利用定点突变技术，将4个Gly分别突变成与其结构性质相近的Ala。在含有盐胁迫培养基上观察MdMLP423突变体对细胞抗逆能力的影响，与野生型MdMLP423WT相比。MdMLP423G47A和MdMLP423G53A在固体胁迫培养基上大肠杆菌菌落数明显减少，接近转化空质粒的菌落数，表明抗逆功能几乎完全丧失，而 MdMLP423G46A和 MdMLP423G48A的菌落数与 MdMLP423WT相似，抗逆功能不变，这说明47位和53位的Gly对MdMLP423发挥抗逆功能是必须的。 （4）MdMLP423表达模式分析。将MdMLP423基因与GFP基因融合后转化烟草叶片，观察绿色荧光信号，结果显示MdMLP423定位于细胞质和细胞核中。利用GUS染色和qRT-PCR两种方法探究MdMLP423在不同组织中的表达情况，发现MdMLP423主要在叶、根、花、果实中表达。另外，非生物处理后，植株的染色加深，暗示MdMLP423响应非生物胁迫。qRT-PCR结果显示MdMLP423在ABA、NaCl、4℃和PEG胁迫处理后表达量均有一定程度的上调，表明MdMLP423的表达受非生物胁迫和ABA的诱导。 （5）超表达MdMLP423提高了拟南芥的抗逆性。将构建好的pROKII-MdMLP423植物表达载体，利用农杆菌介导的花序浸染法转化拟南芥，然后经抗生素筛选和 PCR鉴定得到超表达MdMLP423的纯合株系。在种子的萌发和根长实验中对野生型（WT）和 MdMLP423 超表达株系进行NaCl、甘露醇和外源 ABA 胁迫处理，与 WT 比。MdMLP423 超表达株系的种子萌发率明显高于 WT；在多种胁迫处理下，MdMLP423超表达株系的根长明显比WT的长。另外，还对超表达株系和WT的成苗进行了相应的胁迫处理，发现MdMLP423超表达株系和WT没有明显的差别。种子的萌发以及幼苗的根长实验表明，MdMLP423能够提高幼苗期拟南芥的抗逆能力。 （6）MdMLP423 提高了植物的抗逆能力可能与 ABA 信号途径有关。为了探究MdMLP423的抗逆机理，我们利用qRT-PCR的方法检测了ABA合成及信号途径的系列相关基因在WT和MdMLP423超表达株系中的表达变化。在非胁迫条件下，这些基因在WT和超表达株系中的表达量基本一致；在NaCl处理后，发现MdMLP423超表达株系中ABA信号转导途径的关键基因KINI、AnnAt1和ROS清除基因SOD、CAT的表达量明显高于WT，且ROS含量明显低于野生型。结果表明MdMLP423提高植物的抗逆能力可能与ABA信号途径及活性氧的清除有关。

目录

声明

符号说明

1 前言

1.1乳胶蛋白（Major latex proteins,MLP）的发现

1.2 MLP家族属于Bet v 1超家族

1.3 MLP的结构

1.4 MLP参与生物胁迫的响应

1.5 MLP参与植物的生长与发育过程

1.6 MLP参与非生物胁迫

1.7 研究目的及意义

2 材料和方法

2.1材料

2.2实验方法

3 结果与分析

3.1苹果MdMLP423生物信息学分析

3.2 在原核系统中探究MdMLP423的非生物胁迫抗性

3.3 Gly-rich loop及其保守甘氨酸对MdMLP423功能的影响

3.4 MdMLP423的表达特征

3.5 MdMLP423参与非生物胁迫响应

4讨论

4.1 Gly-rich loop是MLP发挥生物学功能的关键

4.2 MdMLP423响应非生物胁迫

4.3 MdMLP423可能通过ABA信号途径响应非生物胁迫

5结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的论文