玉米赤霉烯酮对断奶仔猪免疫毒性及生殖毒性的影响

摘要

作为中国饲料原料及配合饲料中检出水平最高的霉菌毒素之一，饲料中玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEA）具有和雌激素类似的结构。ZEA能够通过参与雌激素应答基因的激活扰乱激素代谢，引起生殖系统功能异常。饲粮中ZEA的存在，是导致生猪繁殖障碍的重要因素，也是动物性早熟的重要原因之一。近年来，ZEA污染越来越普遍，母猪因摄入ZEA污染饲料造成繁殖力下降和免疫抑制的情况严重阻碍了生猪产业的发展。 为了研究不同水平ZEA污染饲粮对断奶仔猪免疫毒性和生殖毒性的影响，并进一步探索Wnt/β-catenin在ZEA诱导断奶仔猪卵巢发育中的作用机制。试验将40头健康三元杂交（杜×长×大）断奶仔猪按日龄（35 ± 1 d）和平均体重（14.01 ± 0.86 kg）随机分为4个处理，单笼饲养。对照组饲喂基础饲粮，试验1、2和3组分别在基础饲粮基础上添加0.5、1.0及1.5 mg/kg ZEA（ZEA的测定值分别为0.52 ± 0.07、1.04 ± 0.03和1.51 ± 0.13 mg/kg），预饲期10 d，正式期35 d。结果表明：ZEA对断奶仔猪的平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）和料重比（F/G）均没有显著影响（P＞0.05），然而，随着饲粮ZEA水平的升高，饲粮F/G呈一次线性降低的趋势（P=0.075）；与对照组相比，断奶仔猪血清中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px，0.5、1.0和1.5 mg/kg ZEA）活性、猪瘟（1.0和1.5 mg/kg ZEA）和伪狂犬（1.5 mg/kg ZEA）抗体水平以及外周血淋巴细胞增殖率（1.0和1.5 mg/kg ZEA）显著降低，丙二醛（MDA，0.5、1.0和1.5 mg/kg ZEA）含量显著（P＜0.05）升高；随着饲粮中ZEA水平的升高，断奶仔猪的卵巢指数呈现一次线性升高（P<0.01）趋势；1.0 mg/kg ZEA处理组的卵巢指数显著高于1.5 mg/kg处理组（P＜0.05），1.5 mg/kg处理显著高于0.5 mg/kg处理和对照组（P＜0.05）；卵巢雌激素受体α（Estrogen Receptorα，ERα）、雌激素受体β（Estrogen Receptorβ，ERβ）、孕激素受体（Progesterone Receptor，PR）、Wnt-1、β连环蛋白（β-catenin）、糖原合酶激酶（Glycogen Synthase Kinase 3β，GSK-3β）的mRNA相对表达量均呈一次（P<0.01）线性升高，ERα，ERβ，PR，Wnt-1，β-catenin，GSK-3β的蛋白相对表达量同样呈现出一次（P<0.01）线性升高趋势；免疫组化结果显示断奶仔猪卵巢中ERα、ERβ和PR免疫阳性物质均主要分布于原始卵泡和生长卵泡的卵母细胞及颗粒细胞、卵泡膜细胞及血管壁细胞；随着饲粮ZEA水平的升高，卵巢初级卵母细胞数量逐渐减少(P<0.001)，生长卵泡逐渐增多(P<0.001)，1.0 mg/kg组生长卵泡数量达到最高，1.5 mg/kg组出现大批闭锁卵泡。随着饲粮中ZEA和卵泡闭锁程度的增加，卵巢内ERα、ERβ和PR免疫阳性反应明显增强，但ERα、ERβ和PR免疫阳性物质的分布位置并没有因ZEA水平的增加发生明显改变。 以上结果表明，（1）饲粮ZEA（0.5 mg/kg）足以诱导断奶仔猪血清的氧化应激反应，且与饲粮ZEA呈剂量效应；（2）饲粮ZEA（1.0 mg/kg）足以诱导断奶仔猪的免疫毒性与细胞毒性；（3）饲粮中ZEA（0.5~1.5 mg/kg）通过调控PR、ERs/GSK-3β，介导激活经典的Wnt/β-catenin信号通路，进而改变卵泡生长进程，改变卵巢发育，诱发生殖毒性。

目录

声明

缩略语（Abbreviations）

前言

1.1玉米赤霉烯酮的生物学特性及体内代谢

1.1.1玉米赤霉烯酮的生物学特性

1.1.2玉米赤霉烯酮的吸收及代谢

1.2玉米赤霉稀酮的污染与毒性效应

1.2.1玉米赤霉烯酮污染的普遍性

1.2.2玉米赤霉烯酮的细胞毒性与氧化应激

1.2.3玉米赤霉烯酮的生殖毒性

1.2.4玉米赤霉烯酮的免疫毒性

1.3Wnt/β-catenin信号通路

1.3.1Wnt/β-catenin信号通路对生殖系统的影响

1.3.2Wnt/β-catenin信号通路影响卵巢发育

1.3.3Wnt/β-catenin信号通路的调节机制

2 材料与方法

2.1试验材料与试验设计

2.1.1试验材料

2.1.2试验设计与饲养管理

2.1.3玉米赤霉烯酮污染饲粮的配制

2.1.4饲粮常规养分和毒素的测定

2.1.5主要试剂的配制

2.2样品采集与指标测定

2.2.2血样的采集、处理与测定

2.2.3血清抗氧化物酶和丙二醛分析

2.2.4抗体水平分析

2.2.5淋巴细胞增殖率的测定

2.2.6 HE染色法

2.2.7免疫组化（超敏二步法）

2.2.8 ERα、ERβ及PR的累积光密度值（IOD）测定

2.2.9卵巢组织RNA的提取及相关基因相对表达量的测定

2.2.10卵巢雌激素受体及Wnt/β-catenin通路相关因子蛋白质相对表达量的测定

2.3数据统计

3 结果与分析

3.1玉米赤霉烯酮对断奶仔猪生产性能、血清抗氧化和免疫功能的影响

3.1.1玉米赤霉烯酮对生产性能的影响

3.1.2玉米赤霉烯酮对断奶仔猪血清抗氧化指标的影响

3.1.3玉米赤霉烯酮对断奶仔猪血清抗体水平的影响

3.1.4外周血淋巴细胞增殖率

3.2 玉米赤霉烯酮对断奶仔猪卵巢发育、雌孕激素受体分布表达及WNT/β-catenin通路的影响

3.2.1玉米赤霉烯酮对断奶仔猪卵巢器官指数的影响

3.2.2玉米赤霉稀酮对断奶仔猪卵巢组织形态学的影响

3.2.3玉米赤霉稀酮对断奶仔猪卵巢内ERs累积光密度值及不同卵泡比例的影响

3.2.4玉米赤霉稀酮对断奶仔猪卵巢ERα分布的影响

3.2.5玉米赤霉稀酮对断奶仔猪卵巢ERβ分布的影响

3.2.6玉米赤霉稀酮对断奶仔猪卵巢PR分布及其mRNA相对表达量的影响

3.2.7玉米赤霉稀酮对断奶仔猪卵巢ERs、WNT-1、β-catenin和GSK-3β的mRNA以及蛋白质相对表达量的影响

4 讨 论

4.1玉米赤霉烯酮对断奶仔猪生产性能、血清抗氧化和免疫功能的影响

4.1.1玉米赤霉烯酮对断奶仔猪生长性能的影响

4.1.2玉米赤霉烯酮对断奶仔猪血清抗氧化指标的影响

4.1.3玉米赤霉烯酮对断奶仔猪血清抗体水平的影响

4.1.4玉米赤霉烯酮对断奶仔猪外周血淋巴细胞增殖率的影响

4.2.1玉米赤霉烯酮对断奶仔猪卵巢器官指数的影响

4.2.2玉米赤霉烯酮对断奶仔猪卵巢组织形态学的影响

4.2.3玉米赤霉烯酮对断奶仔猪卵巢PR分布和表达的影响

4.2.4玉米赤霉烯酮对断奶仔猪卵巢ERs分布和表达的影响

4.2.5玉米赤霉烯酮对断奶仔猪卵巢Wnt-1，β-catenin和GSK-3β表达的影响

5 结 论

6 创 新 点

7 后续研究及展望

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况