中华蜜蜂和意大利蜜蜂耐寒性能差异比较及其机理的研究

摘要

蜜蜂个体是变温动物，其体温会伴随着外界环境温度的变化而改变。蜜蜂种群为了适应外界低温环境的威胁，通常会采取行为改变结合调控体内生理生化物质的策略避免冻伤，我们将这种耐受寒冷而能生存的特性称之为蜜蜂耐寒性。不同蜂种的耐寒性能也不尽相同。实践中发现，中华蜜蜂（Apis cerana cerana，简称中蜂）比意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica，简称意蜂）表现出更优异的抗寒能力，但其机理尚不清晰。本研究开展了中蜂和意蜂耐寒性能差异比较，并探讨了耐寒机理。分为以下三个试验： 试验一：意大利蜜蜂耐寒性能季节性变化的研究。试验对象是5群群势一致的意蜂。分别于蜂群的越冬前期、越冬中期、越冬后期3个时期采集蜜蜂样品，各时期每群采集40只。测定蜜蜂耐寒指标，包括过冷却点、糖原、甘油和小分子糖醇等耐寒物质以及抗寒相关基因（Vg、AFP、L(2)efl）mRNA水平的表达变化，并进行统计分析。结果如下：（1）意蜂越冬期不同阶段的过冷却点差异显著（P＜0.05）。意蜂过冷却点的变化与本地外界环境温度变化趋势相符，呈现明显的季节性变化趋势。（2）耐寒指标变化如下：意蜂蜂体总蛋白含量从越冬前期至越冬后期总体呈现先上升后下降的趋势（P＜0.05）。意蜂蜂体糖原含量在越冬前期迅速升高到峰值，显著高于越冬期（P＜0.05）。越冬期甘油含量与初期和后期相比含量差异显著（P＜0.05）。意蜂血淋巴中三种小分子糖含量在越冬期间均呈现先上升后下降的趋势。（3）意大利蜜蜂AFP、L(2)efl以及Vg基因在整个越冬期间的表达规律：意蜂AFP 基因的mRNA表达在越冬中期始终保持在一个较低的水平（P＜0.05）。L(2)efl基因的mRNA表达量呈现先上升后下降的趋势（P＜0.05）。同样Vg基因的表达水平在6个时间点也出现了显著性变化（P＜0.05）。 试验二：自然蜂群情形下中华蜜蜂和意大利蜜蜂耐寒性能差异比较。试验对象是越冬中期5群群势一致的中蜂和意蜂蜂群。每群采集50只蜜蜂样品。观察测定耐寒指标包括：过冷却点、冰点、水分、脂肪、糖原、蛋白质、小分子糖的含量、海藻糖酶活性、相关基因表达的差异以及早春（2017年3月）中蜂和意蜂蜂巢温度及出勤采集能力，并进行统计分析。结果如下：（1）在早春外界气温较低时，中蜂和意蜂巢内温度差异不显著；中蜂出勤时间明显早于意蜂，并且出勤采集花粉能力明显强于意蜂（P＜0.05）。（2）越冬期中蜂和意蜂过冷却点差异显著，中蜂的过冷却点显著低于意蜂（P＜0.05），但二者冰点没有显著性差异（P＞0.05）；（3）越冬期中蜂和意蜂蜂体含水量存在显著差异，中蜂体内游离水含量显著低于意蜂（P＜0.05），而结合水含量显著高于意蜂（P ＜0.05）；越冬中期蜂体脂肪含量在两蜂种间差异不显著（P＞0.05）；中蜂和意蜂蜂体和血淋巴蛋白质含量差异不显著（P＞0.05）；意蜂在越冬期时体内糖原含量明显低于中蜂，并且差异显著（P＜0.05）；中蜂血淋巴中甘露醇、山梨醇含量接近于意蜂的两倍，海藻糖含量也相对高于意蜂，差异显著(P＜0.05)；中蜂蜂体和血淋巴的海藻糖酶活性均显著低于意蜂（P＜0.05）；（4）以中蜂为对照组，实时荧光定量 PCR 检测意蜂的海藻糖酶基因（Tre-2）和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因（UGP）表达量明显高于中蜂（P＜0.05）；而基因 Tre-1 表达情况相反；海藻糖合成酶基因（TPS）表达量在中蜂和意蜂体内无显著差异（P＞0.05）。 试验三：低温胁迫室内离群饲养中华蜜蜂和意大利蜜蜂抗氧化能力及耐寒相关基因表达。以正常越冬中期的蜜蜂作为对照组，中蜂和意蜂各5盒，每盒70只，并提供充足水和糖水。首先置于4℃低温条件下记录二者冻僵率变化，然后置于16℃低温条件下储存15min、30min、45min、1h和1.5h测定蜂体三种抗氧化酶活性变化情况。选取5个编码耐寒相关蛋白的基因并检测其在低温胁迫下mRNA水平的表达变化，并进行统计分析。结果如下：（1）中蜂在4℃低温胁迫下的冻僵速率显著低于意大利蜜蜂。（2）中蜂在低温保存过程中，蜂体三种总抗氧化酶活性随着低温胁迫时间的延长均明显升高（P＜0.05）。（3）意蜂与中蜂Vg、TPS和SOD 基因在低温保存过程中表达量均显著上调，CAT 基因的mRNA表达水平被抑制，不同的是短时低温胁迫下意蜂L(2)efl 基因的mRNA 表达水平显著下调，处理组一直处于低表达状态，而中蜂 L(2)efl mRNA 表达水平则被诱导上调明显（P＜0.05）。在低温保存30min时意大利蜜蜂蜂体POD 活性达到峰值，且显著高于对照组（P＜0.05），而对SOD 活性影响不明显（P＞0.05）。 本研究表明，意蜂的耐寒性呈现明显的季节性变化特点，耐寒能力的变化规律与其体内主要生化物质具有相关性；中蜂耐寒性能高于意蜂，并且差异显著；蜜蜂的耐寒性能由蜂体抗氧化能力和耐寒相关基因表达共同作用，构成其抵御低温的耐寒应答机制。

目录

声明

符号说明

1 前 言

1.1 昆虫耐寒性研究进展

1.2 昆虫耐寒性的定义与类型

1.3 昆虫耐寒性与过冷却能力

1.4 昆虫的耐寒机制

1.5 影响昆虫耐寒性的因素

1.6 昆虫耐寒性的研究方法

1.7 昆虫耐寒性研究的实际运用

1.8 本研究的目的及意义

2 材料与方法

2.1 意大利蜜蜂耐寒性能季节性变化的研究

2.2 自然蜂群中华蜜蜂和意大利蜜蜂耐寒性能差异比较

2.3 低温胁迫室内离群饲养中华蜜蜂和意大利蜜蜂抗氧化能力及耐寒相关基因表达

3 结果与分析

3.1 意大利蜜蜂耐寒性能季节性变化的研究

3.2 自然蜂群情形下中华蜜蜂和意大利蜜蜂耐寒性能差异比较

3.3 低温胁迫越冬期中华蜜蜂和意大利蜜蜂

4 讨论

4.1 蜜蜂过冷却点与耐寒性的关系

4.2 体现蜜蜂越冬性能的主要指标

4.3 蜜蜂耐寒性能与其品种相关

4.4 蜜蜂对低温胁迫存在应答机制

5 总体结论、创新点与研究展望

5.1 总体结论

5.2 创新点

5.3 研究展望

参考文献

致谢

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