奶牛脂肪肝血清诊断模型的建立与肝组织蛋白生物标记物的筛选

摘要

成母牛产后有很大概率患有代谢性综合疾病，常常伴随胎衣不下、真胃变位、生产瘫痪及生育能力下降等。对脂肪肝奶牛的治疗费用增加以及奶产量下降收益减少给奶牛养殖业带来了巨大的经济损失。有研究表明，奶牛围产早期的诊断和预防可以减少脂肪肝代谢性疾病的发生。本研究的目的：1）测定产后奶牛血清指标与肝脏脂肪含量，利用血清指标与脂肪含量建立方程。2）通过蛋白质组学研究，找到脂肪肝发生时肝组织的生物学标记物。实验在山东枣庄和山东东营两个规模化奶牛养殖场，实验共采集产后423头奶牛的血清样品和24头奶牛肝脏组织。血清共测定11个血清指标：包括AST、TP、ALB、UERA、UA、GLU、TG、TCHO、NEFA、BHBA、INS。24头牛的肝脏组织通过油红O染色测定脂肪含量。计算血清指标与肝脏油红O结果的相关性，利用AST、GLU和TCHO三个血清指标与脂肪含量模拟线性回归方程,得到的回归方程如下所示C=1.68772-0.00008523AST-0.40724GLU-0.05079TCHO当方程的C＜0.05时可初步判断奶牛脂肪含量低于5%，为正常奶牛；当方程0.05＜C＜0.20时可初步判断奶牛的脂肪含量介于5%-20%之间为轻度脂肪肝奶牛；当方程0.20＜C＜0.85时初步判断奶牛脂肪含量介于20%-75%之间为中度脂肪肝奶牛；当方程C＞0.85时，初步判断奶牛脂肪含量超过75%为重度脂肪肝奶牛。在24头奶牛中筛选出脂肪含量低于（7%±7%）的6头肝脏组织和脂肪含量高于（85%±6%）的8头肝脏组织做串联质谱标签（TMT）蛋白质组学分析。通过质控后共鉴定到4838个蛋白质，其中有4816个蛋白有定量信息。以1.2倍变化为阙值，t-test P＜0.05为标准，定量后的蛋白中共检测到140个上调表达蛋白，100个下调表达蛋白。在对这140个上调表达蛋白和100个下调表达蛋白进行了GO、KEGG的生物信息学分析以及PPI的蛋白网络互作图，共找到7个上调蛋白和9个下调蛋白可能与脂肪肝发生显著相关。

目录

声明

缩略词说明

1. 前言

1.1 奶牛脂肪肝的研究进展

1.2 脂肪肝的发病机理

1.2.2 肝脂代谢

1.2.3 VLDL代谢

1.3 奶牛脂肪肝的分类

1.4 脂肪肝的诊断

1.4.1 肝脏活检

1.4.2 血清指标参数模拟方程

1.4.3 脂肪肝奶牛的血清指标或标记物的代谢变化

1.4.4 影像学诊断

1.5 奶牛脂肪肝的预防

1.5.1 正常奶牛预防措施

1.5.2 奶牛轻度或中度脂肪肝的治疗

1.5.3 奶牛重度脂肪肝的治疗

1.6 蛋白质组学的研究进展

1.6.1 蛋白质的一级质谱定量

1.6.2 蛋白质的二级质谱定量

1.6.3 气-质联用（GC-MS）质谱

1.6.4 液-质联用（LC-MS）质谱

1.7 蛋白组在奶牛组织上的的运用

1.7.1 泌乳期的牛乳蛋白质组学分析

1.7.2 蛋白质组学在奶牛的代谢性酮病中的研究

1.7.3 非酒精性脂肪肝的蛋白质组学研究

1.8 本研究的目的

2. 材料方法

2.1 实验场地和实验对象

2.2 实验仪器

2.3 样品采集

2.3.1 血清采集

2.3.2 肝脏组织采集

2.4 血清指标检测

2.4.1 游离脂肪酸（NEFA）的测定原理及操作步骤

2.4.2 BHBA的测定原理及操作步骤

2.4.3 胰岛素测定原理及操作步骤

2.4.4 油红O染色

2.5 肝脏组织做蛋白质组学的筛选过程

3. 结果与分析

3.1 180头奶牛11个血清指标分布状况

3.2 方程Y筛选24头奶牛血清指标分布状况

3.3 油红O染色结果

3.4 方程Y与各血清指标的相关性

3.5 脂肪含量与血清指标的相关性分析

3.6 模拟方程指标的筛选

3.7 蛋白质浓度测定

3.8 蛋白质质控

3.9 生物信息学分析

3.10 GO分析结果

3.11 KEGG代谢通路分析结果

3.12 KEGG通路分析和蛋白结构的聚类分析热图

4.讨论

4.1 模拟方程在大群中验证可靠性

4.2 更新后的方程与Reid提出方程之间对比

4.3 显著表达蛋白参与代谢途径

4.4 上调表达蛋白

4.4.1 LDHA、LDHB在胰高血糖素中的表达

4.4.2 CPT1A肉碱酰基转移酶

4.4.3 GK葡萄糖激酶

4.4.4 PLIN2蛋白2

4.4.5 PC丙酮酸羧化酶

4.5 表达下调蛋白

4.5.1 FABP1脂肪酸结合蛋白

4.5.2 ACAD8异丁酰辅酶A脱氢酶

4.5.3 ACACA乙酰辅酶A羧化酶α

4.5.4 AOX1乙醛氧化酶

5.结论

参考文献

致谢