番木瓜环斑病毒西瓜株系的致病机制与弱毒突变体应用

摘要

番木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus，PRSV）属于马铃薯Y病毒属（Potyvirus），根据寄主范围可以分为P（PRSV-P）和W（PRSV-W）两个株系。PRSV-W主要侵染西葫芦、甜瓜等葫芦科作物，可引起叶片卷曲、畸形、花叶和泡斑，植株矮化等症状，造成果实畸形或在表面形成水渍状环斑，降低了产量和品质，严重时甚至绝产。目前PRSV在中国、波兰、印度、巴西等地均有发生，是危害葫芦科作物生产的重要病毒。本研究获得并分析了 PRSV 山东分离物（PRSV-SD）的全基因组序列，构建了PRSV-SD全长侵染性cDNA克隆，筛选出PRSV弱毒突变体并验证了其交叉保护效果。 从山东济南采集到叶片表现畸形、花叶，果实表面环斑的西葫芦样品，经检测其中含PRSV。通过RT-PCR分段扩增其全基因组片段并进行序列测定，结果表明，除了3′-端poly（A）尾以外，PRSV-SD基因组全长10337核苷酸（nt）， 5′-和3′-NCR分别为90nt和206 nt，开放阅读框编码3346个氨基酸。PRSV-SD与另外18个PRSV分离物的全基因组核苷酸一致率为82.0%~89.3%，多聚蛋白的氨基酸一致率为90.6%~94.7%。系统发育分析结果表明，PRSV可以分为亚洲组和美洲组，PRSV-SD 聚类到亚洲组。选择压力分析表明，PRSV-SD 的 11 个蛋白基因均处于负向选择，但是在P1、P3、6K1、NIa-pro和NIb中存在正向选择位点。 通过体外DNA同源重组的方式，将PRSV-SD全基因组克隆到含有35S启动子的农杆菌双元载体pCambia0390上，获得质粒pCamPRSV-W，利用农杆菌浸润将pCamPRSV接种西瓜（Citrullus lanatus）、西葫芦（Cucurbita pepo）、甜瓜（Cucumis melo）、黄瓜（Cucumis sativus）等葫芦科作物，发病率均为100%，且症状和病毒积累量均与野生型PRSV-W相似。在此基础上，在病毒 NIb和CP基因编码蛋白的蛋白酶识别位点之间插入gfp基因，获得质粒pCamPRSV-W-GFP，农杆菌浸润接种甜瓜等四种葫芦科作物。接种后第五天，在紫外灯下观察到接种子叶上有绿色荧光；接种后第八天，绿色荧光在系统叶片上主要沿叶脉分布；接种后第十五天，绿色荧光布满整个系统叶片，且表现出花叶、褪绿、卷曲症状，表明pCamPRSV-W可用来表达外源蛋白。 以pCamPRSV-W-GFP为基础，通过定点突变分析了HC-Pro中调控病毒致病力的保守氨基酸位点，获得了弱毒突变体。农杆菌浸润甜瓜后第十五天，突变体gC26A、gC57A、gK125D、gK126D、gN137A、gG317K、gP328A、gN346A、gL375A和gV417A在甜瓜上的症状与野生型相比明显减弱，Western blotting检测结果表明，突变体病毒蛋白积累水平均显著低于野生型病毒。 以pCamPRSV-W为模板获得弱毒突变体C57A、K125D、G317K、P328A，农杆菌浸润接种甜瓜子叶；不同保护间隔期后通过汁液摩擦将带有GFP 标签的PRSV-W 接种到系统叶片，挑战接种后第十天观察症状并检测 GFP 积累量。间隔期为三天、五天时，系统叶片均表现不同程度的褪绿、卷曲等症状，紫外灯下有较强的绿色荧光，与对照无明显差异，说明间隔三天或五天所有弱毒突变体均无保护效果。间隔保护期为十天时，突变体C57A、P328A表现轻微褪绿，绿色荧光较弱；突变体 K125D、G317K 无明显症状，紫外灯下无绿色荧光，交叉保护效率100%。

目录

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缩略词表

1 引言

1.1 番木瓜环斑病毒（PRSV）研究进展

1.2 植物RNA病毒侵染性克隆

1.3 交叉保护在植物病毒病防治中的作用

1.4 研究目的与意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3 结果与分析

3.1 PRSV山东分离物全基因组序列克隆与分析

3.2 PRSV山东分离物侵染性cDNA克隆

3.3 HC-Pro突变对PRSV-SD致病力的影响

3.4 弱毒突变体的交叉保护效果

4 讨论

4.1 番木瓜环斑病毒基因组分析

4.2 植物RNA病毒侵染性cDNA克隆

4.3 HC-Pro氨基酸位点对PRSV-W致病力的影响

4.4 PRSV-W弱毒突变体的交叉保护作用

5 结论

参考文献

附录

致谢

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