灰霉菌和叶霉菌诱导番茄抗性基因表达的时空特异性分析

摘要

在长期进化过程中，植物应对病原体侵害生成了精细的防御机制。植物依赖于抗性基因的时空特异性表达实现了对病原体的响应，不同类型的病原体诱导了抗性基因不同的表达模式。解析植物防御病原体侵染的分子机制并提高作物免疫能力是一项重要的研究内容。番茄是重要的经济作物，同时也是研究植物免疫反应的经典模式植物。灰霉菌是和叶霉菌分别是腐生营养型真菌和活体营养型真菌的典型代表，二者对番茄生产造成巨大的经济损失。本研究以番茄灰霉菌和叶霉菌为研究对象，探索死体营养型病原体和活体营养型病原体诱导抗性基因表达的特征，以期找到植物响应死体营养型病原体和活体营养型病原体的标记基因，并利用标记基因解析植物免疫的分子机理。我们利用灰霉菌和叶霉菌对番茄进行侵染试验，通过荧光定量 PCR 检测抗性基因表达的时空表达。研究结果发现，灰霉菌和叶霉菌侵染诱导的抗性基因表达具有时空特异性。其中抗性基因蛋白酶抑制剂基因PI-II（Proteinase inhibitors）和TD（Threonine Deaminase）在侵染24小时内表达，是早期诱导基因；而病程相关基因PR-STH2以及PR1等在侵染3天后表达量最高，是晚期诱导基因。同时发现灰霉菌和叶霉菌侵染只能在侵染部位诱导抗性基因表达，而在未侵染部位不诱导抗性基因表达。我们进一步构建了带有黄色荧光蛋白YFP 荧光标签的 PI-II 转基因植物用于研究植物早期响应灰霉菌的分子机制。主要获得了以下研究结果： 1、两类病原体分别接种栽培种 CM，在不同时间点取样，设置三次生物学重复，通过荧光定量PCR技术，发现不同的抗性基因被病原体诱导的时间顺序存在差异，PI-II、TD被划分为早期诱导基因，而ERF.C3、JA2L、PR-STH2、PR1是晚期诱导基因。 2、两类病原体分别接种栽培种 CM，在接种部位以及未接种部位取样，设置三次生物学重复，通过荧光定量PCR技术，发现PI-II、TD、ERF.C3、JA2L、PR-STH2、PR1在未接种病原体的部位抗性基因的表达量很低。 3、利用 gateway 同源重组的原理，构建带有荧光标签的抗性基因过表达载体，通过农杆菌转化，已经获得转基因材料。PCR验证T0代植株的信号表达情况，发现部分材料有荧光标签的导入，对这部分材料定植用于繁种，为今后试验奠定基础。

目录

声明

符 号 说 明

1 引言

1.1 植物病原体抗性反应机制的研究进展

1.1.1番茄病害现状

1.1.2 番茄常见病原体分类

1.1.3 抗病基因-无毒基因互作机理

1.1.4 植物的免疫防卫反应

1.1.5 番茄中抗病基因克隆

1.2 植物抗病防卫反应的基本信号通路

1.2.1 水杨酸信号转导途径

1.2.2 茉莉酸信号转导途径

1.3 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 植物材料

2.1.2菌株与质粒

2.1.3生化试剂

2.1.4 主要仪器设备

2.1.5 常用培养基的配置

2.1.6 常用抗生素的配置

2.1.7溶液的配置

2.2 试验方法

2.2.1 植物培养

2.2.2 转基因植物载体构建

2.2.3 转基因番茄的获得

2.2.4 病原体的分离与鉴定

2.2.5 B. cinerea侵染番茄叶片

2.2.6 C. fulvum侵染番茄叶片

2.2.7 番茄基因组DNA的提取

2.2.8 番茄叶片RNA的提取及定量PCR分析

3 结果与分析

3.1抗性基因时间表达差异统计

3.1.1 B. cinerea诱导的抗性基因表达

3.1.2 C. fulvum诱导的抗性基因表达

3.2 抗性基因空间表达差异统计

3.2.1 B. cinerea诱导的抗性基因表达

3.2.2 C. fulvum诱导的抗性基因表达

3.3 转基因番茄鉴定结果

4 讨论

4.1 抗性基因时空表达谱的构建

4.2 番茄转基因株系的构建

5 结论

参考文献

致谢