枝顶孢霉胞内细菌多样性分析

摘要

枝顶孢霉是食品中有广泛应用的一种真菌。本论文以枝顶孢霉为研究对象，采用乳酸酚棉蓝染色和电镜技术初步观察枝顶孢霉AS1中胞内细菌，采用4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）荧光染色进一步观察枝顶孢霉AS1、枝顶孢霉3.2058和枝顶孢霉3.5905中的胞内细菌。通过原生质体爆破法培养分离鉴定胞内菌。测定分析枝顶孢霉AS1胞内菌的16S rDNA分析胞内菌群的微生物多样性。为研究枝顶孢霉细胞内生细菌的现象，细菌与真菌之间的关系奠定了基础。本论文主要结论如下： （1）乳酸酚棉蓝染色观察到枝顶孢霉AS1胞内菌的存在。在枝顶孢霉AS1的菌丝内部能够观察到细菌，胞内细菌形态大小不一，可在菌丝中移动。 （2）采用电镜技术观察到枝顶孢霉AS1胞内菌的存在。可见在清晰地枝顶孢霉细胞中有胞内细菌。 （3）DAPI荧光染色观察枝顶孢霉胞内菌。经DAPI染色后，可以观察到枝顶孢霉菌丝中有大小不均的荧光点，大量的分布于枝顶孢霉的样本菌丝和孢子中。 （4）枝顶孢霉AS1微生物多样性分析。通过测定分析枝顶孢霉AS1胞内菌的16S rDNA分析胞内菌群的微生物多样性。比对数据库可知，枝顶孢霉AS1的3份样品（G1代、G2代、G3代）细菌菌群分为：不动杆菌（Acinetobacter sp.）、葡糖酸醋杆菌（Gluconacetobactersp.）、霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）、嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）和未知菌种（Unknow）。 G1代和G3代经过菌群演替后，胞内细菌的组成相似性较高。G1代主要有寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）、鞘氨醇单胞菌属（sphingomonas）、不动杆菌属（Acinetobacter）、丙酸菌属（Propionibacterium）。G2代主要有寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）、鞘氨醇单胞菌属（sphingomonas）。 （5）宿主真菌不同代数之间的细胞内细菌有很大差异。枝顶孢霉AS1、枝顶孢霉3.2058和枝顶孢霉3.5905胞内菌培养分离鉴定。枝顶孢霉分离得到的胞内菌DNA扩增16S rDNA后，测得16S rDNA序列，在NCBI中进行BLAST比对之后。枝顶孢霉AS1G1代培养分离得到的细菌有芽孢杆菌（Bacillus sp.）、微球菌（Micrococcus sp.）。G2代培养分离得到的细菌有芽孢杆菌（Bacillus sp.）。G3代培养分离得到的细菌有芽孢杆菌（Bacillus sp.）。 枝顶孢霉3.2058G1代培养分离得到的细菌有葡萄球菌（Staphylococcus hominis）、 耶氏副球菌（Paracoccus yeei）、微杆菌（Microbacteriumsp.）、两面神菌（Janibactersp.）。G2代分离得到的细菌有两面神菌（Janibacter sp.）。G3代培养分离得到的细菌有盖球菌（Kytococcus sp.）。 枝顶孢霉3.5905G1代培养分离得到的细菌有葡萄球菌（Staphylococcus hominis）、库克菌（Kocuria rosea）。G2代培养分离得到的细菌有芽孢杆菌（Solibacillus silvestris）。G3代培养分离得到的细菌有芽孢杆菌（Bacillus sp.）。

目录

声明

符号说明

1 前言

1.1 胞内菌的研究现状

1.2 枝顶孢霉简介

1.3 微生物多样性研究常用方法

1.3.1 传统培养技术

1.3.2 rDNA文库构建

1.3.3 变性梯度凝胶电泳

1.3.4 荧光原位杂交技术（FISH）

1.4 电镜

1.4.1扫描电镜

1.4.2 透射电镜

1.5 荧光染色技术

1.5.1 DAPI荧光标记

1.5.2 Live/Dead baclight细菌染色

1.6 研究的背景目的意义

1.7 研究内容

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌株来源

2.1.2 仪器

2.1.3 试剂

2.1.4 实验溶液及培养基配制

2.2 实验方法

2.2.1 枝顶孢霉孢子准备

2.2.2 乳酸酚棉兰染色观察

2.2.3 透射电镜观察

2.2.4 扫描电镜观察

2.2.5 DAPI荧光染色

2.2.6 微生物多样性分析

2.2.7 胞内菌分离

2.2.8胞内菌鉴定

3 结果与分析

3.1 胞内菌的检测

3.1.1 乳酸酚棉蓝染色

3.1.2 透射电镜观察

3.1.3 扫描电镜观察

3.1.4 DAPI染色

3.2 枝顶孢霉微生物多样性分析

3.2.1 测序信息

3.2.2 枝顶孢霉微生物多样性分析

3.2.3 物种注释及分类学分析

3.2.4 Alpha细菌群落多样性

3.2.5 Beta多样性分析

3.3 枝顶孢霉胞内菌分离

3.3.1 枝顶孢霉AS1 胞内细菌分离

3.3.2 枝顶孢霉3.2058胞内细菌分离

3.3.3 枝顶孢霉3.5905胞内细菌分离

4 讨论

5 结论

5.1 枝顶孢霉AS1胞内菌观察

5.2 枝顶孢霉DAPI荧光染色观察

5.3 枝顶孢霉AS1微生物群落多样性分析

5.4 枝顶孢霉胞内细菌培养分离鉴定

参考文献

致谢