一个黄瓜干旱响应基因的克隆及其功能分析

摘要

黄瓜(Cucumis sativusL.)作为最重要的蔬菜之一,其叶片面积大、根系浅且对水分需求量大.干旱胁迫会导致黄瓜产量严重降低,造成巨大的经济损失.为了应对干旱胁迫,黄瓜在长期进化过程中逐渐形成了复杂而又高效的防御机制,包括多种转录因子、多重信号转导途径以及各种功能基因等.而目前对黄瓜响应干旱胁迫的研究大多停留在生理层面,其应对干旱胁迫的分子机制研究则鲜有报道.本实验室前期对5-氨基乙酰丙酸缓解的黄瓜干旱胁迫进行了甲基化敏感扩增多态性(MSAP)分析,本研究在此基础上分离了一个功能未知、响应干旱胁迫的黄瓜基因,并命名为HG-9.我们从分子及生理生化等方面对该基因进行功能分析与验证,为研究黄瓜抵御干旱胁迫的分子机制提供了一定的理论依据.主要研究结果如下: (1)HG-9基因序列分析表明,该基因全长2527bp,其中CDS序列长度为1938bp,共编码645个氨基酸序列的蛋白质.其含有一个外显子以及长度为2126bp的启动子序列.该基因在黄瓜中的表达具有组织特异性,且在叶片中表达量较高.亚细胞定位分析显示,该基因蛋白定位于细胞质中.同时,HG-9基因在多种非生物胁迫下均有不同程度的诱导表达,在干旱胁迫以及赤霉素(GA)条件下,该基因表现为显著的上调表达,而水杨酸(SA)和脱落酸(ABA)则能明显地抑制HG-9基因的表达水平. (2)HG-9基因瞬时沉默和瞬时超表达黄瓜植株在干旱胁迫下的抗性分析显示,该基因的上调表达能够显著增强植株的干旱耐受性.超表达植株MDA、O2·-及H2O2含量显著低于野生型植株以及沉默植株,且在沉默植株中含量最高.而通过相关抗氧化酶活性测定表明,在干旱胁迫下超表达植株体内抗氧化酶活性显著提高,这也是其在干旱下具有较强抗旱性的重要原因. (3)超表达HG-9基因能够显著提高转基因拟南芥的抗旱性.在干旱条件下超表达HG-9转基因拟南芥种子具有更快的萌发率.同时,转基因拟南芥成苗在干旱胁迫下表现为较强的抗旱性,其体内游离脯氨酸及可溶性糖含量显著高于野生型植株.此外,转基因拟南芥具有更高的抗氧化酶活性及较少的MDA、O2·-及H2O2含量,且差异显著. (4)通过对多个响应干旱胁迫的拟南芥Marker基因进行qRT-PCR表达分析,初步证明该基因参与了非ABA信号转导途径.

目录

声明

缩略词说明

1 前言

1.1干旱胁迫对植物生长发育的影响

1.2干旱胁迫对植物体内抗氧化酶的影响

1.2.1活性氧的产生及危害

1.2.2植物体内存在的抗氧化系统

1.3干旱胁迫对植物游离脯氨酸及可溶性糖含量的影响

1.4植物响应干旱胁迫的内在机制

1.4.1植物抗旱生理生化机制

1.4.2活性氧自由基的清除机制

1.4.3 ABA信号转导途径

1.4.4植物应对干旱胁迫的分子机制

1.5植物抗旱相关基因研究现状

1.6本课题的目的与意义

2 材料与方法

2.1实验材料

2.1.1植物材料

2.1.2菌株与载体

2.1.3酶及各种生化试剂

2.1.4引物序列

2.2实验方法

2.2.1目的基因的克隆

2.2.2植物表达载体的构建

2.2.3目的基因在烟草表皮的瞬时表达

2.2.4 目的基因瞬时侵染黄瓜表达

2.2.5转基因拟南芥植株的获得

2.2.6实时荧光定量PCR

2.2.7生理生化指标测定

3 结果与分析

3.1黄瓜HG-9基因的克隆与序列分析

3.1.1黄瓜HG-9基因的克隆

3.1.2黄瓜HG-9基因的序列分析

3.2黄瓜HG-9蛋白的亚细胞定位分析

3.3黄瓜HG-9基因组织特异性表达分析

3.4黄瓜HG-9基因启动子元件分析

3.4.1 HG-9基因启动子序列中的顺式作用元件

3.4.2 HG-9基因启动子顺式作用元件分析

3.5 HG-9基因瞬时侵染黄瓜表达在干旱胁迫下的抗性分析

3.5.1干旱胁迫下HG-9基因瞬时侵染黄瓜表型与表达分析

3.5.2干旱胁迫下HG-9基因瞬时侵染黄瓜MDA、O2·-及H2O2含量的影响

3.5.3干旱胁迫下HG-9基因瞬时侵染黄瓜抗氧化酶活性的影响

3.6超表达HG-9转基因纯合拟南芥的获得

3.6.1植物表达载体的构建

3.6.2转基因纯合拟南芥的获得

3.7干旱胁迫下超表达HG-9转基因拟南芥的抗性分析

3.7.1干旱胁迫下超表达HG-9转基因拟南芥种子萌发率分析

3.7.2干旱胁迫下超表达HG-9转基因拟南芥表型与表达分析

3.7.3干旱胁迫下超表达HG-9转基因拟南芥脯氨酸和可溶性糖含量的影响

3.7.4干旱胁迫下HG-9转基因拟南芥MDA、O2·-及H2O2含量的影响

3.7.5干旱胁迫下HG-9转基因拟南芥抗氧化酶活性的影响

3.8 HG-9基因参与非ABA信号转导途径

4 讨论

4.1 HG-9基因生物信息学分析

4.2 HG-9基因启动子元件分析

4.3 HG-9基因瞬时侵染黄瓜表达分析

4.4 HG-9转基因拟南芥在干旱胁迫下抗性分析

4.5 HG-9基因参与的信号转导途径

5 结论

参考文献

致谢