黄瓜中一个高温响应基因和一个干旱响应基因的克隆及功能分析

摘要

黄瓜（Cucumis sativus L.）为葫芦科黄瓜属一年生草本植物，是主要的栽培蔬菜之一，随着设施农业的发展，种植面积逐年增加。非生物胁迫如干旱、高温是黄瓜栽培过程中常见的逆境因子，严重影响黄瓜的品质和产量。为了降低逆境胁迫的影响，黄瓜在长期的进化过程中逐渐形成了复杂而高效的防御应对机制，包括多种功能基因、各种转录因子和多重信号调控通路等。 本实验室通过对黄瓜叶片基因组DNA进行甲基化敏感扩增多态性（MSAP）分析，分离了两个功能未知、分别响应高温和干旱胁迫的黄瓜基因，命名为HG-7和HG-8，其序列分别与黄瓜基因组数据库中编号为Csa025705和Csa002838的基因序列相同。本研究从生理生化和分子水平对这两个基因的功能进行了分析与验证。主要研究结果如下： （1）HG-7基因序列分析表明，该基因CDS序列长度为351bp，编码116个氨基酸的肽链。该基因在黄瓜中的表达具有组织特异性，且在子叶和叶片中表达量较高。亚细胞定位分析表明HG-7在细胞质中表达。 （2）通过对HG-7基因的启动子序列分析发现，启动子存在干旱、脱落酸（ABA）、水杨酸（SA）和茉莉酸甲酯（MeJA）等顺式作用元件。通过qRT-PCR方法分析HG-7基因的表达模式，结果表明该基因可以受干旱、高温、ABA、SA和MeJA的诱导表达。 （3）HG-7基因瞬时超表达和瞬时沉默黄瓜植株在高温胁迫下的抗性分析显示，该基因的上调表达能够增强植株的高温耐受性。高温胁迫下，超表达植株MDA、O2.-和H2O2含量显著低于野生型植株和沉默植株，并且超表达植株具有更高的抗氧化酶活性和抗氧化剂含量。 （4）超表达HG-7基因能够提高拟南芥的高温耐受性。转基因拟南芥在高温胁迫下表现为显著的基因上调表达。同时，转基因拟南芥具有更高的抗氧化酶活性和抗氧化剂含量，以及较少的MDA、O2.-和H2O2含量。 （5）HG-8基因序列分析表明，该基因序列全长1023bp，其中CDS序列长度为894bp，编码297个氨基酸序列的多肽。其含有一个外显子以及长度为2450bp的启动子序列。该基因在黄瓜中的表达具有组织特异性，且在花中表达量较高。亚细胞定位分析表明HG-8在细胞质中表达。 （6）通过对HG-8基因的启动子序列分析发现，启动子存在赤霉素（GA）、水杨酸（SA）和生长素（IAA）等顺式作用元件。用qRT-PCR方法分析HG-8基因的表达模式，结果表明该基因可以受干旱、GA、SA和IAA的诱导表达。 （7）HG-8基因瞬时超表达和瞬时沉默黄瓜植株在干旱胁迫下的抗性分析显示，该基因表达量的减少能够增强植株的干旱耐受性。干旱胁迫下，沉默植株MDA、O2.-和H2O2含量显著低于野生型植株和超表达植株，并且沉默植株具有更高的抗氧化酶活性和抗氧化剂含量。

目录

声明

符号说明

1 前言

1.1植物与逆境

1.2逆境胁迫对植物的影响

1.2.1高温胁迫对植物的影响

1.2.2干旱胁迫对植物的影响

1.3植物应对逆境胁迫的机制

1.3.1渗透平衡调节

1.3.2功能蛋白合成

1.3.3激素调节

1.3.4信号转导

1.4瞬时表达技术

1.4.1瞬时表达技术的方法

1.4.2瞬时表达技术的应用

1.5黄瓜抗逆相关基因研究现状

1.6本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1实验材料

2.1.1植物材料、菌株与载体

2.1.2酶与各种生化试剂

2.1.3引物

2.2实验方法

2.2.1黄瓜的培养与处理

2.2.2植物基因组DNA的提取

2.2.3植物总RNA的提取

2.2.4 cDNA的合成

2.2.5实时定量PCR

2.2.6黄瓜目的基因的扩增与载体构建

2.2.7农杆菌GV3101感受态细胞的转化

2.2.8外源基因在烟草叶片中的瞬时表达

2.2.9瞬时表达载体侵染黄瓜幼苗

2.2.10拟南芥转基因植株的获得

2.2.11生理生化指标测定

2.2.12实验数据分析

3 结果与分析

3.1黄瓜HG-7基因的克隆与功能分析

3.1.1黄瓜HG-7基因的克隆及序列分析

3.1.2黄瓜HG-7蛋白的亚细胞定位分析

3.1.3黄瓜HG-7基因组织特异性表达分析

3.1.4黄瓜HG-7基因启动子元件分析

3.1.5瞬时表达HG-7基因黄瓜在高温胁迫下的抗性分析

3.1.6超表达HG-7转基因拟南芥的获得

3.1.7 HG-7转基因拟南芥在高温胁迫下的抗性分析

3.2黄瓜HG-8基因的克隆与功能分析

3.2.1黄瓜HG-8基因的克隆及序列分析

3.2.2黄瓜HG-8蛋白的亚细胞定位分析

3.2.3黄瓜HG-8基因组织特异性表达分析

3.2.4黄瓜HG-8基因启动子元件分析

3.2.5瞬时表达HG-8基因黄瓜在干旱胁迫下的抗性分析

3.2.6超表达HG-8转基因拟南芥的获得

4 讨论

4.1黄瓜HG-7基因和HG-8基因亚细胞定位分析

4.2黄瓜HG-7基因和HG-8基因组织特异性表达分析

4.3黄瓜HG-7基因和HG-8基因启动子元件分析

4.4 HG-7基因瞬时侵染黄瓜表达分析

4.5 HG-7转基因拟南芥在高温胁迫下的抗性分析

4.6 HG-8基因瞬时侵染黄瓜表达分析

5 结论

参考文献

致谢