中华蜜蜂MKK6基因介导的MAPK级联途径在氧化应激中的功能分析

摘要

丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路是细胞内重要的信号转导途径，能够被细胞因子、激素和各种细胞应激源等刺激物激活，进而调控细胞对外界刺激的响应。MAPK信号通路在生长发育、氧化应激和免疫反应中发挥重要作用。中华蜜蜂（Apis cerana cerana）是中国主要的蜜蜂品种，对维持生态和农业发展的平衡具有重大贡献。然而自然生态环境的恶化使中华蜜蜂的生存与繁殖受到了威胁，因此了解中华蜜蜂在氧化应激中的防御机制对其种群的发展具有重要意义。本研究以中华蜜蜂为实验材料，开展了MKK6基因的功能研究，从分子水平上探讨了AccMKK6介导的MAPK级联途径在抵抗氧化应激反应中的功能。具体研究结果如下： 通过PCR的方法从中华蜜蜂中分离获得AccMKK6的开放阅读框，长度为1002bp，编码一个333个氨基酸残基的多肽，预测蛋白分子量约为37.63kDa，理论等电点为7.15。通过氨基酸序列比对以及进化树分析发现，中华蜜蜂AccMKK6的氨基酸序列与其他物种有较高的同源性，且具有高度保守的磷酸化位点和催化结构域。 通过qRT-PCR方法对AccMKK6基因在中华蜜蜂不同组织部位和发育时期的表达特性进行了研究。研究结果发现，AccMKK6基因在胸部的表达量最高，其次是表皮和头部；AccMKK6在中华蜜蜂各个发育阶段中均有表达，蛹期表达量较高。 中华蜜蜂AccMKK6基因响应非生物胁迫引起的氧化应激反应。通过qRT-PCR方法探究了AccMKK6在非生物胁迫中的表达特性，结果发现，AccMKK6基因的转录水平受过氧化氢、重金属和农药等非生物胁迫诱导提高。Western blot结果在蛋白水平上进一步证明AccMKK6受非生物胁迫的调控。 过表达AccMKK6蛋白的大肠杆菌对非生物胁迫的抗性增强。通过抑菌实验分析重组AccMKK6蛋白的功能，结果发现在H2O2和HgCl2处理后过表达AccMKK6的大肠杆菌的抑菌圈小于对照组。 中华蜜蜂AccMKK6基因沉默后抗氧化基因表达量和抗氧化酶活性降低。将dsAccMKK6注射入成年蜜蜂体内，qRT-PCR和Western blot结果显示，蜜蜂体内AccMKK6的表达量显著下降。通过检测AccSOD1，AccSOD2，AccGSTS4，AccCYP4G11，AccGSTO2和AccGSTD基因表达水平发现，这些抗氧化相关基因的转录水平在AccMKK6沉默后降低。检测到AccMKK6沉默后中华蜜蜂体内超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）活性降低，但是丙二醛（MDA）含量升高。 AccMKK6-Accp38b-Acckayak级联途径参与中华蜜蜂抗氧化应激过程。通过酵母双杂交和GST pull-down实验得到AccMKK6的下游基因Accp38b，并发现Accp38b与Acckayak互作。研究发现Acckayak基因的转录水平受过氧化氢、重金属和农药等非生物胁迫诱导提高。同时，AccMKK6沉默后Accp38b和Acckayak的转录水平升高。

目录

声明

符号说明

1 前言

1.1中华蜜蜂的生物学特征及重要地位

1.2 MAPK级联途径的概述

1.2.1 MAPK级联途径的组成

1.2.2 MAPK信号通路的主要途径

1.3 MAPK级联途径的生物学功能

1.3.1 MAPK级联途径在氧化应激中的作用

1.3.2 MAPK级联途径在免疫中的作用

1.3.3 MAPK级联途径在生长发育中的作用

1.3.4 MAPK级联途径在疾病中的作用

1.4 MKK6基因的概述

1.4.1 MKK6的结构

1.4.2 MKK6的研究进展

1.5本研究的目的及意义

2 材料与方法

2.1材料

2.1.1昆虫材料

2.1.2菌株与质粒

2.1.3酶与其他生化试剂

2.1.4引物

2.1.5网络资源和生物学软件

2.2实验方法

2.2.1中华蜜蜂的饲养与处理

2.2.2中华蜜蜂总RNA的提取

2.2.3 cDNA第一链的合成

2.2.4中华蜜蜂AccMKK6及Acckayak基因开放阅读框的获取

2.2.5目的DNA的回收、连接及转化

2.2.6大肠杆菌质粒DNA的提取与酶切鉴定

2.2.7实时荧光定量PCR分析基因的表达情况

2.2.8 目的基因的原核表达

2.2.9抗体的制备

2.2.10 Western blot分析

2.2.11抑菌实验

2.2.12双链RNA（dsRNA）的合成及AccMKK6沉默

2.2.13 AccMKK6基因沉默后样品中的抗氧化酶的活性

2.2.14酵母双杂交实验验证互作关系

2.2.15 GST pull-down实验

3 结果与分析

3.1中华蜜蜂AccMKK6基因分离及生物信息学分析

3.1.1中华蜜蜂AccMKK6基因的分离

3.1.2中华蜜蜂AccMKK6编码的氨基酸序列分析

3.2中华蜜蜂AccMKK6基因表达特性分析

3.2.1中华蜜蜂AccMKK6基因在不同发育时期与不同组织部位中的表达特性分析

3.2.2中华蜜蜂AccMKK6基因在不同非生物胁迫中的表达特性分析

3.2.3环境胁迫下AccMKK6蛋白的表达特性分析

3.3重组AccMKK6蛋白在氧化应激中的保护作用

3.3.1重组AccMKK6蛋白的原核表达

3.3.2抑菌实验分析重组AccMKK6蛋白功能

3.4 RNAi介导的中华蜜蜂AccMKK6基因沉默

3.4.1中华蜜蜂AccMKK6基因沉默效率的检测

3.4.2 AccMKK6基因沉默对中华蜜蜂的影响

3.5中华蜜蜂AccMKK6和Accp38b相互关系

3.6中华蜜蜂Accp38b和Acckayak相互关系

3.6.1中华蜜蜂Acckayak基因的分离

3.6.2中华蜜蜂Acckayak编码的氨基酸序列分析

3.6.3中华蜜蜂Accp38b与Acckayak相互作用

3.6.4中华蜜蜂Acckayak基因在不同非生物胁迫中的表达特性分析

3.7中华蜜蜂AccMKK6沉默后Accp38b和Acckayak的表达量

4 讨论

4.1 AccMKK6具有高度保守性

4.2 AccMKK6响应非生物胁迫引起的氧化应激反应

4.3 AccMKK6基因沉默对中华蜜蜂的影响

4.4 AccMKK6-Accp38b-Acckayak级联途径调控中华蜜蜂抗氧化应激

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的论文及成果