犬瘟热病毒和犬细小病毒的分离与鉴定及其单克隆抗体的研制

摘要

目的：本研究拟分别从宁夏地区疑似犬瘟热感染病犬的粪便拭子和犬细小病毒感染病犬的粪便拭子中，分离鉴定宁夏犬瘟热病毒(CDV)和犬细小病毒(CPV)毒株，并制备相应的单克隆抗体，为犬瘟热和犬细小病毒病的早期快速诊断和预防治疗提供研究基础。
　　方法：1.收集宁夏地区疑似犬瘟热感染病犬的粪便拭子和犬细小病毒感染病犬的粪便拭子预处理后，分别接种非洲绿猴肾细胞系（Vero）和猫胎肾细胞系(FK81)进行病毒的分离培养，并观察细胞毒性改变（CPE）。
　　2.37℃/-20℃冻融收获分离培养的病毒，并对收获的CDV、CPV分别进行鉴定。鉴定试验有：病毒毒力测定（TCID50）、透射电镜观察病毒颗粒形态、特异性PCR鉴定及间接免疫荧光试验（IFA）检测。
　　3.对分离培养鉴定出的CDV、CPV病毒分别浓缩纯化后，分别免疫6-8周龄的雌性BALB/c小鼠，并在二次免疫两周后同时剪尾巴采血测小鼠体内血清抗体效价，为细胞融合做准备。同时建立间接ELISA检测方法。
　　4.制备CDV和CPV免疫脾细胞，分别与小鼠骨髓瘤细胞（SP20）、BALB/c小鼠饲养细胞进行细胞融合。融合后加入HAT培养基进行筛选，12天后更换为HT培养基。对间接ELISA检测阳性的融合孔利用有限稀释法进行克隆化，并随时检测克隆化后单克隆孔抗体分泌情况。将筛选出的间接ELISA检测3次以上阳性的单克隆孔扩大培养并保存。
　　5.将筛选出的抗CDV单克隆抗体株和抗CPV单克隆抗体株分别进行杂交瘤细胞染色体计数、单克隆抗体亚型鉴、效价检测、特性性和稳定性检测和单克隆抗体抗原表位分析及单克隆抗体亲和层析柱纯化。
　　结果：1.Vero细胞接种疑似犬瘟热感染病料盲传至第四代时，90％以上细胞发生CPE改变；透射电镜从形态学方面观察到病毒液中有形状不规则，直径在200nm左右，有囊膜的病毒颗粒；RT-PCR特异性鉴定和N基因全长扩增分别在484bp和1572bp处出现与预期大小一致的目的片段；IFA试验在细胞胞质中可观察到点状的特异性绿色荧光。
　　2.FK81细胞接种疑似犬细小病感染病料盲传至第三代时，90%以上细胞发生CPE改变；透射电镜从形态学方面观察到病毒液中呈现立体对称、圆形、无囊膜，直径在20～23nm之间的实心病毒颗粒；PCR特异性鉴定和VP2基因全长扩增分别在209bp和1755bp处出现与预期大小一致的目的片段；IFA试验可观察到围绕细胞核的特异性绿色荧光。
　　3.利用间接ELISA筛选出3株抗CDV单克隆杂交瘤细胞，分别为C6细胞株、G10细胞株、H2细胞株；筛选出3株抗CPV单克隆杂交瘤细胞株，分别为B8细胞株、E10细胞株、F12细胞株。
　　4.3株抗CDV单克隆杂交瘤细胞染色体数目都在90条以上，效价较低，亚型鉴定都为IgG1型且抗原表位相同，经鉴定为同一株单克隆杂交瘤细胞；3株抗CPV单克隆杂交瘤细胞染色体数目都在95条以上，效价相对高，亚型鉴定B8株和F12株为IgG1型，E10株为IgM型，抗原表位不同，特异性高，稳定性好。
　　结论：成功分离培养并鉴定出宁夏地区的CDV和CPV各1株。成功筛选出3株抗CDV单克隆杂交瘤细胞，对其特性和生物活性进行鉴定，为同一杂交瘤细胞株；成功筛选出3株抗CPV单克隆杂交瘤细胞，可以和不同抗原表位结合，为后续制备CPV诊断试剂盒和高效特异性的犬细小病毒单抗生物制剂奠定了基础。

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封面

声明

中文摘要

英文摘要

中英文对照表

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前言

第一部分 犬瘟热病毒的分离培养与鉴定

材料与方法

实验结果

讨论

第二部分 犬细小病毒的分离培养与鉴定

材料与方法

实验结果

讨论

第三部分 犬瘟热病毒单克隆抗体和犬细小病毒单克隆抗体的研制

材料与方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

文献综述:犬瘟热病毒和犬细小病毒的研究进展

致谢

四、攻读学位期间发表的学术论文

五、个人简历