一株鸡源呼肠孤病毒的分离鉴定及防污染RT-LAMP检测法的建立

摘要

禽呼肠孤病毒（avian reovirus，ARV）属于呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属，可引起鸡的病毒性关节炎、矮小综合征、呼吸道疾病、肠道疾病、免疫抑制等。导致肉鸡饲料转化率低、增重下降、生长不齐，蛋鸡除跛行外还会引起产蛋量下降、孵化率下降等，增加了养殖成本。自1985年我国首次报道禽呼肠孤病毒感染以来，此后多个省市地区均出现了该病的报道，感染情况日益加重，严重危害养禽业的发展。深化该病的研究对于我国养鸡产业的健康和稳定发展具有积极的意义。本研究从疑似ARV感染的免疫肉鸡体内分离得到一株ARV，对该毒株进行了序列分析及理化性质的研究。同时建立了一种快速可消除携带污染的UDG-RT-LAMP检测方法，并对该方法的反应条件进行了优化，为ARV感染的防控及快速检测提供了理论依据和新思路。 本研究分别利用SPF鸡胚和鸡胚肝细胞（CEL）对山东潍坊地区疑似ARV感染的免疫肉鸡关节病料进行了病毒病原的分离，将分离株命名为WF株，对分离毒株进行了序列的测定与分析、毒力的测定、动物回归试验、理化性质的测定等试验。鸡胚和CEL细胞接种病料处理液后出现的特征性病变均与报道相符。分别提取RNA，RT-PCR反应扩增产物的条带大小与预期相符。σC基因的遗传进化分析表明，该分离株属于第四分支，与参考株核苷酸同源性为50.3%~74.7%，氨基酸同源性为22.7%~54.3%，其中与常用疫苗株1733、2408、S1133的同源性均较低。分离株的ELD50为10-5.25/0.2mL，TCID50为10-5.29/0.1mL，对60℃、70℃敏感，对50℃、氯仿不敏感，在pH3.0~9.0范围内保持稳定。动物回归试验表明，1日龄健康S P F雏鸡感染该毒株后，临床表现及剖检变化与自然发病病例一致。 根据ARV M1基因设计了一套特异性LAMP扩增引物，初步建立了ARV检测的UDG-LAMP体系，并进行了反应条件的优化。优化结果为dNTP浓度为1.2mM，MgSO4浓度为8mM，Bst2.0WarmStart DNA聚合酶浓度为320U/mL，65℃扩增60min。该方法特异性好，仅能对ARV进行扩增；灵敏度高，最低检测限为3×102拷贝/μL，是PCR方法的100倍；防携带污染作用明显。在临床样品检测中，UDG-RT-LAMP法的阳性检出率比RT-PCR法高16.7%，表明建立的UDG-RT-LAMP检测法在临床检测应用中更具有优势。

目录

声明

符号说明

1 前言

1.1 禽呼肠孤病毒概述

1.1.1 病毒分类

1.1.2 培养特性

1.1.3 分子生物学

1.1.4 流行病学和分子流行病学

1.1.5 诊断方法

1.2 环介导等温扩增概述

1.2.1 引物设计

1.2.2 反应过程

1.2.3 结果判定

1.2.4 LAMP反应中的污染及防污染研究

1.2.5 LAMP技术在动物病原检测中的应用

1.3 研究目的与意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 细胞、质粒与毒株

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要实验仪器与设备

2.1.4 实验动物与鸡胚

2.2 实验方法

2.2.1 一株禽呼肠孤病毒的分离与鉴定

2.2.2 一株禽呼肠孤病毒理化性质的测定

2.2.3 防污染RT-LAMP检测方法的建立及应用

3 结果

3.1 一株禽呼肠孤病毒分离鉴定结果

3.1.1 病毒的分离结果

3.1.2 RT-PCR反应结果

3.1.3σC基因的遗传进化分析

3.1.4 ELD50的测定结果

3.1.5 TCID50的测定结果

3.1.6 动物回归试验结果

3.2 一株禽呼肠孤病毒理化性质的测定结果

3.2.1 耐热性试验结果

3.2.2 酸碱度稳定性试验结果

3.2.3 氯仿敏感性试验结果

3.3 防污染RT-LAMP检测方法的建立结果

3.3.1 阳性质粒的构建结果

3.3.2 LAMP反应条件的优化结果

3.3.3 敏感性试验结果

3.3.4 特异性试验结果

3.3.5 防污染试验结果

3.3.6 临床样品检测结果

4 讨论

4.1 一株鸡源呼肠孤病毒的分离鉴定及理化性质分析

4.2 防污染RT-LAMP检测方法的建立分析

5 结论

参考文献

致谢