貂源肺炎双球菌和金黄色葡萄球菌的毒力基因检测及其致病性研究

摘要

水貂是重要的经济动物之一，已发展形成重要的养殖产业。山东省是水貂养殖第一大省，但是随着集约化、规模化养殖模式的形成，疫病严重妨碍了水貂养殖业的健康发展，造成了很大的经济损失。出血性肺炎是危害水貂的重要疫病之一。近年来，本实验室对水貂出血性肺炎进行了流行病学调查，结果表明，除了绿脓杆菌、克雷伯菌、巴氏杆菌等致病菌外，应该还有其他的病因。为此，本研究对肺炎双球菌（Streptococcus pneumoniae,S.pneumoniae）和金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus,S.aureus）在水貂群中的流行情况进行了调查，并对其致病性进行研究，阐明两者在水貂出血性肺炎中的作用。 自2017-2018年期间，从山东诸城水貂养殖场采取水貂肺炎病料120份，共分离到2株肺炎双球菌（Sp-1，Sp-2）和3株金黄色葡萄球菌（Sa-6，Sa-16，Sa-24）。 采用分子克隆测序技术，分别对所分离的肺炎双球菌的9种毒力基因、金黄色葡萄球菌的17种毒力基因进行检测、分析。结果表明，2株肺炎双球菌均携带ply、nanA、lytA、pspA、psaA及rrgA基因，Sp-1分离株还携带有pavA，hysA毒力基因，而iga基因均为阴性；3株金黄色葡萄球菌分离株中，Sa-16，Sa-24分离株为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），Sa-6分离株为甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA），其中MSSA携带pvl基因，3株金黄色葡萄球菌均携带coa、nuc和clfA基因，其中，Sa-6，Sa-24两株同时携带hla、hlb、hld和hlg4种溶血素基因及FnbpB毒力基因，肠毒素作为食物中毒病例中重要的致病因素之一，在本研究中只有Sa-6分离株肠毒素seb、seg基因检测为阳性，表皮剥落毒素基因eta、etb及tsst-1均未检出。 采用纸片扩散法对5株细菌的耐药性进行了检测，共使用9大类共21种抗生素。本研究中Sp-1，Sp-2分离株对罗红霉素完全耐药，对哌拉西林、头孢噻肟、头孢他啶、头孢西丁、庆大霉素和阿米卡星均敏感。2株MRSA菌株相较于不携带mecA基因的菌株，MRSA菌株对临床上常用的抗生素具有更高程度的耐药性，对青霉素类（氨苄西林、青霉素）和磺胺类（复方新诺明）药物完全耐药，只有部分喹诺酮类（环丙沙星、诺氟沙星）、头孢菌素类（头孢他啶、头孢西丁）药物对Sa-16，Sa-24分离株显示较好的抑菌作用。Sa-6分离株对复方新诺明完全耐药，喹诺酮类、硝基呋喃类、糖肽类及多数头孢菌素类药物均对MSSA分离株显示较好的抑菌作用。 根据分离菌株毒力基因检测结果，分别选取肺炎双球菌分离株Sp-1和金黄色葡萄球菌分离株Sa-6进行致病性研究。在小鼠致病性试验中，通过腹腔接种途径对小白鼠进行攻毒试验，结合临床症状观察及小鼠发病时间和死亡率数据统计，结果表明，Sa-6分离株对小鼠的致病性比Sp-1分离株强。之后，回归实验动物，将Sp-1分离株和Sa-6分离株分别通过腹腔接种、肌肉注射和鼻腔接种共3种不同攻毒途径感染水貂。根据感染水貂不同器官中目的菌回收率，并结合组织病理学变化，确定了分离株对水貂具有致病性，同时比较肺炎双球菌和金黄色葡萄球菌经不同途径感染，其对水貂致病性强弱的差异。结果表明：肺炎双球菌分离株经鼻腔感染水貂，病原菌更易通过在鼻咽部的定植，进而从鼻咽部经呼吸道下行，引起肺部感染，而金黄色葡萄球菌分离株则易经破损的皮肤感染水貂，引起水貂化脓性感染、蜂窝织炎等。 本研究表明，肺炎双球菌和金黄色葡萄球菌在貂群中存在，并可引起水貂肺炎病征。这一结果丰富了水貂出血性肺炎的研究数据，具有重要的公共卫生学意义和生产实践意义。

目录

声明

符号说明

前言

1.1 肺炎双球菌的研究进展

1.1.1 病原学

1.1.2 致病机理

1.1.3 肺炎双球菌毒力因子

1.1.4 流行病学

1.2 金黄色葡萄球菌的研究进展

1.2.1 病原学

1.2.2 致病机理

1.2.3 金黄色葡萄球菌毒力因子

1.2.4 流行病学

1.3 本研究的目的与意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验仪器

2.3 实验试剂

2.4 实验方法

2.4.1 细菌的分离鉴定

2.4.2 小白鼠致病性试验

2.4.3 水貂致病性实验

2.4.4 病理组织学检测

3 实验结果

3.1 细菌的分离鉴定

3.2 毒力基因检测

3.3 药敏试验

3.4 小鼠致病性试验

3.5 水貂致病性实验

3.6 病理组织学检测

4 分析与讨论

5 结论

参考文献

致谢

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