貂源绿脓杆菌血清型和毒力基因的检测及其致病性研究

摘要

绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa，P.aeruginosa)，是一种非常普遍的条件性人类病原体，在潮湿和湿润的环境中生长旺盛，能够利用多种有机化合物，它能引起包括水貂在内的多种生物致病。由绿脓杆菌导致的出血性肺炎是养殖水貂中最昂贵的传染病之一，在水貂生产中通常会导致重大的经济损失。本研究对分离自水貂的绿脓杆菌血清型和毒力基因进行了检测并对其致病性进行了研究，这些研究对绿脓杆菌病的防治和监测工作提供了重要的理论依据，在临床实践和未来的研究中有重要的意义。 在2016年6月至2016年9月，从山东诸城、聊城、临沂等地共采集112份水貂病料，通过常规细菌分离培养技术，对这112份病料进行细菌的分离鉴定。由根据菌落色素沉着，存在芳香性状气味，能在42度生长和在4度下不生长等特性挑选可疑菌落20株。并通过扩增16SrRNA基因进一步确认，在NCBI中的BLAST分析，进一步证实了这些确实是绿脓杆菌。 采用玻片凝集实验的方法对20株水貂绿脓杆菌进行了14种血清型（A-N）的检测。使用的是绿脓杆菌诊断血清试剂盒。结果这20株绿脓杆菌被鉴定为三种血清型。其中有18 株 属 于 血 清 型 G ， 包 括 P.aeruginosa-CS-1 到 P.aeruginosa-CS-10和P.aeruginosa-CS-13 到P.aeruginosa-CS-20。一株（P.aeruginosa-CS-12）属于血清型B，一株（P.aeruginosa-CS-11）属于血清型C。其中P.aeruginosa-CS-11与P.aeruginosa-CS-20是分离自同一株水貂但是血清型是不同的。绿脓杆菌血清型G分离率在90%，绿脓杆菌血清型B、血清型C型各占5%。 采用PCR的方法对毒力基因exoT，plcH，algD，aprA，exoY，exoS，toxA，lasB， exoU，lasA，phzS，phzM进行检测，结果显示毒力基因exoT检出率是60%，毒力基因plcH检出率是85%，毒力基因algD检出率是95%，毒力基因aprA检出率是75%，毒力基因exoY检出率是80%，毒力基因exoS检出率是65%，毒力基因toxA检出率是60%，毒力基因lasB检出率是70%，毒力基因exoU检出率是0%，毒力基因lasA检出率是70%，毒力基因phzS检出率是60%，毒力基因phzM检出率是55%。由此可见这些绿脓杆菌的毒力基因（exoT，plcH，algD，aprA，exoY，exoS，toxA，lasB，lasA， phzS，phzM）在水貂感染上都是主要的。遗传进化分析和同源性分析结果表明从水貂上分离的绿脓杆菌与人源的亲缘关系很近，有潜在感染人的风险。 为了比较血清型相同的不同菌株是否存在致病性上的差异，选取P.aeruginosa-CS-2和P.aeruginosa-CS-10两个菌株进行了动物实验。最终P.aeruginosa-CS-2的LD50结果为4.6×105，P.aeruginosa-CS-10的LD50结果为6.8×104。剖检死亡水貂可见肺脏存在大面积出血现象，脾脏淤血肿大，肝脏出血红肿，心包积液，心肌变性。肾有大小不一的出血点，伴有淋巴结充血肿大。病理组织学检查结果发现，水貂肺间质增宽，心包炎，肝细胞变性，脾脏有炎性细胞。对照组并没有表现出任何的临床症状。P.aeruginosa-CS-2在6-10小时内首先表现出临床症状，P.aeruginosa-CS-10无明显临床症状，这种情况可能与Exotoxin A有关，外毒素A(toxA)在临床感染中是一种很重要的毒性因子，是由绿脓杆菌的其一些毒力因素中最致命的因素，但是具体的机制还需要进一步研究。

目录

声明

符 号 说 明

1前言

1.1绿脓杆菌的简介

1.2 绿脓杆菌研究进展

1.2.1 病原学

1.2.2 绿脓杆菌的传播机制

1.2.3 绿脓杆菌的群体感应系统

1.2.4 致病性及其致病因子

1.2.5 绿脓杆菌的毒力因子及毒力基因

1.2.6 绿脓杆菌的流行病学

1.2.7 绿脓杆菌对水貂狐狸貉子的感染

1.2.8 临床症状及病理变化

1.2.9 临床诊断

1.3 预防与治疗

1.4 研究目的与意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1菌株来源

2.1.2 实验动物

2.1.3 主要仪器与试剂

2.2 方法

2.2.1 细菌的分离鉴定

2.2.2 绿脓杆菌的分离鉴定

2.2.3 血清型鉴定

2.2.4 细菌DNA的提取

2.2.5 毒力基因的检测

2.2.6 针对毒力基因的分析

2.2.7 水貂致病性试验

2.3水貂绿脓杆菌的鉴定

3 结果

3.1 菌株鉴定结果

3.2 血清型鉴定结果

3.3分离菌株各段基因的PCR扩增结果

3.4分离菌株各段基因的酶切鉴定结果

3.5 毒力基因检测结果及系统发育分析

3.5.1毒力基因检测

3.5.2系统进化分析

3.5.3同源性分析

3.6 动物实验结果

3.7水貂的致病性试验结果

3.7.1临床症状及病理变化

3.7.2死亡水貂病理组织观察

3.8 死亡水貂绿脓杆菌的鉴定结果

4讨论

5 结论

参考文献

致谢