辣椒疫霉效应因子RxLR 121致病功能特性的研究

摘要

辣椒疫霉作为一种能够侵染辣椒、番茄、本氏烟和拟南芥的具有广泛寄主的流行性土传病害病原菌，可以引起十分难以防治的植物疫病，该病原菌于1922年美国的新墨西哥州被首次报道。植物病原微生物通过分泌效应因子来协助自身的侵染与拓展。辣椒疫霉分泌的大多数效应因子具有调节寄主的免疫并促进自身的侵染的功能，只有少数的效应因子能够被寄主的抗性蛋白识别，触发过敏性坏死反应，从而引起寄主细胞坏死。其中的RxLR效应因子为卵菌效应因子中最大的类群，目前可以在FungiDB网站上查找到的具有RxLR基序的辣椒疫霉效应因子就有1124个，对该类效应因子研究的报道也层出不穷。经过本实验室之前的研究的结果表明，效应因子RxLR121能够引起本氏烟叶片的坏死，并能够抑制激发子INF1引起的细胞死亡，推测其在辣椒疫霉侵染致病的过程中起促进作用，因而本实验对其进行了体内原位的基因沉默和异源植株转化的实验，以进一步探索其致病机理。在进行转基因操作时，本实验去掉了RxLR121的1~23位氨基酸，将该序列构建到pBIN-eGFP载体上，转化到农杆菌GV3101中。Lamour K等在2012年发表的辣椒疫霉LT1534的全基因组信息为之后研究辣椒疫霉提供了生物信息学依据，使得对于辣椒疫霉相关基因的研究更加方便快捷。本实验采用该菌株为研究对象，探究其中效应因子RxLR121对于辣椒疫霉LT1534菌株的侵染及毒力的影响。通过pTOR-eGFP沉默载体对菌株中的RxLR121进行沉默，进而观察该基因产物在野生型菌株中表达量下降对其侵染及致病性的影响。通过将该效应因子借助pBIN-eGFP载体通过T-DNA随机插入的方式转入Col-0型拟南芥基因组中，观察该外源基因对于拟南芥生长发育的影响，为今后进一步探索该效应因子对于辣椒疫霉侵染及毒力的作用提供基础。实验所得结果如下： 1、对于RxLR121在辣椒疫霉LT1534中对其侵染及毒力的影响，运用RNA干扰技术，以pTOR-eGFP为载体，运用PEG介导的原生质体转化的方法将沉默片段反向插入其中进行基因沉默，qRT-PCR的结果表明获得了2个RxLR121表达量在30%以下的沉默转化子，分别命名为RxLR121-S13和RxRL121-S22，并应用此沉默转化子菌块接种了辣椒和本氏烟叶片，分别在60h、48h后观察叶片坏死情况，运用长波紫外灯进行照射，拍照记录后用台盼蓝溶液进行染色，经水合氯醛脱色之后对染色的坏死部分进行拍照统计。结果表明效应因子RxLR121对于辣椒疫霉的侵染具有促进作用。 2、经体外回补实验证明，在本氏烟叶片上先用含有RxLR121:GFP的农杆菌瞬时表达RxLR12124h之后用沉默转化子的游动孢子侵染，长波紫外灯照射下能够检测到GFP标签和相应的坏死部位，因此该体外回补实验能够成功地使沉默转化子的致病力得到恢复，从而进一步证明了RxLR121对于辣椒疫霉LT1534的侵染及毒力具有一定程度上的贡献作用。 3、经过对供试拟南芥的cDNA的目的基因的扩增和Western Blot验证，证明去信号肽的效应因子RxLR121在基因组中的随机插入对于拟南芥的株高、花序发育和种子的形成具有抑制作用，且抑制作用明显。

目录

声明

1 前言

1.1 疫霉引起的危害、辣椒疫霉引起的病害

1.2 效应因子概述

1.3 植物与病原菌的互作

1.3.1 抗性基因、通路概述

1.3.2 zig-zag模型

1.4 相关实验技术

1.4.1 RNA干扰技术

1.4.2 转基因技术及应用

1.5 研究效应因子的意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1供试辣椒疫霉及植物材料

2.1.2 载体及菌株

2.1.3 酶及试剂

2.1.4 实验仪器设备

2.1.5 培养基

2.1.6 常用试剂的配制

2.2 实验方法

2.2.1 实验用引物

2.2.2 辣椒疫霉基因组DNA的提取

2.2.3 辣椒疫霉RNA的提取

2.2.4 拟南芥RNA的提取

2.2.5 RNA的反转录

2.2.6 效应因子在实验株中的验证

2.2.7 大肠杆菌的转化

2.2.8 质粒小提

2.2.9 质粒中提

2.2.10 琼脂糖凝胶回收

2.2.11 PEG介导的原生质体转化

2.2.12 花序侵染法侵染拟南芥

2.2.13转基因拟南芥的筛选

2.2.14 Western Blot

2.2.15 基因在拟南芥中过表达

2.2.16 辣椒疫霉菌块侵染植物叶片

2.2.17 游动孢子的诱导

2.2.18 沉默回补

3 结果与分析

3.1 RxLR121的序列分析及克隆

3.2 121沉默转化子的验证

3.3 RxLR121沉默转化子毒力验证

3.4 沉默回补实验

3.5 RxLR121转基因

3.5.1RxLR 121:GFP农杆菌验证

3.5.2 RxLR121转基因拟南芥表型

4 讨论

4.1 RxLR121对毒力和侵染的影响

4.2 RxLR121对于寄主发育的影响

5 结论

参考文献

附录

致谢

攻读学位论文期间发表论文情况