辣椒疫霉菌两个RxLR效应因子(RxLR107和RxLR129)功能初步研究

摘要

辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）是一种重要的土传植物病原卵菌，能侵染葫芦科和茄科的70余种植物，常引起多种作物的毁灭性病害，给农业生产造成严重损失。辣椒疫霉易侵染多种蔬菜，导致疫病大发生，辣椒疫病发生与流行常给辣椒生产造成巨大损失。 辣椒疫霉菌侵染寄主过程中会分泌多种效应蛋白，包括RxLR，CRN和NLP等，这些效应蛋白具多种功能，能破坏寄主细胞或诱导寄主产生免疫性能。辣椒疫霉基因组中含400余个RxLR效应因子，仅开展了其中的少数RxLR效应因子免疫特性的研究，大多数RxLR效应因子功能特性尚未明确。 本论文从辣椒疫霉菌克隆鉴定了2个RxLR效应因子RxLR107和RxLR129，利用基因敲除和沉默技术，开展了RxLR107和RxLR129致病功能特性的研究，取得了有价值的研究结果，具体实验过程和结果如下： 1、以实验室保存的辣椒疫霉强致病性标准菌株LT1534为实验材料，分离克隆两个效应分子RxLR107和RxLR129，前期证明RxLR107不引起寄主坏死，但可抑制Bax的功能，而RxLR129可引起叶片坏死，为了进一步探明RxLR107和RxLR129在辣椒疫霉侵染寄主过程的功能特性，本论文借助遗传操作技术分别对这两个基因进行了遗传编辑。 2、利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对RxLR107基因进行敲除实验，获得若干转化子，对敲除转化子DNA进行提取、PCR扩增以及测序验证得到纯合敲除转化子。通过对基因编辑，发现效应因子RxLR107对寄主致病力变化无影响。 3、利用RNA干扰原理技术，沉默RxLR129基因以获得沉默转化子，通过qRT-PCR验证，成功沉默RxLR129效应因子，借助致病性测定技术方法，发现效应因子RxLR129沉默转化子对寄主致病力发生了明显的改变，基因回补之后，致病性恢复，由此证明RxLR129为一关键效应因子。 4、RxLR107效应因子不直接参与致病过程，其致病机理将在后期继续深入研究。RxLR129在辣椒疫霉侵染中发挥重要的作用，实验室筛选了RxLR129互作蛋白乙醛脱氢酶，通过验证效应分子与其互作蛋白关系，有望探明RxLR129效应因子的致病分子机理，本研究为后续研究提供了理论依据与技术借鉴。

目录

声明

符号说明

1 前言

1.1 辣椒疫霉的研究进展

1.1.1 辣椒疫霉生物学特征

1.1.2 辣椒疫霉病症状表现及防治

1.2 效应因子RxLR的简介

1.2.1 RxLR效应因子的功能

1.2.2 RxLR效应因子的作用机制

1.2.3 效应因子RxLR的研究进展

1.3 CRISPR/Cas9的研究

1.3.1 CRISPR/Cas9的研究进展

1.3.2 卵菌CRISPR/Ca9的研究进展

1.4 基因沉默

1.4.1 基因沉默的应用

1.6 目的与意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 实验菌株及植物

2.1.2 载体和菌株

2.1.3 常用酶和生化试剂

2.1.4 实验相关仪器、耗材

2.1.5 常用培养基和相关溶液的配制

2.2 实验方法

2.2.1 生物信息学分析

2.2.2 引物设计

2.2.3 辣椒疫霉RxLR效应因子的克隆

2.2.4 辣椒疫霉效应因子RxLR107的敲除

2.2.5 辣椒疫霉效应因子RxLR129的沉默

2.2.6 TRV病毒诱导的基因沉默

3 结果与分析

3.1 基因克隆

3.2 利用CRISPR/Cas9敲除效应因子RxLR107

3.2.1 设计sgRNA

3.2.2 LT1534菌株中RxLR107序列的上下游各1kb碱基序列的测序结果

3.2.3 辣椒疫霉效应因子RxLR107敲除转化子验证

3.2.4 辣椒疫霉效应因子RxLR107敲除转化子的菌株生长速率

3.2.5 辣椒疫霉菌RxLR107敲除转化子的致病性检测

3.3效应因子RxLR129瞬时表达模式分析

3.4 效应因子RxLR129在辣椒疫霉中的沉默

3.4.1 效应因子RxLR129沉默转化子在辣椒中的致病能力下降

3.4.2 效应因子RxLR129沉默转化子在本氏烟中的致病能力下降

3.4.3 效应因子RxLR129沉默转化子致病性的恢复

3.4.4 效应因子RxLR129在互作蛋白ALDH沉默突变体的毒力验证

4 讨论

5 结论

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表论文情况