苹果细胞分裂素氧化/脱氢酶MdCKX7.2的基因克隆及功能鉴定

摘要

植物的生长发育是一个极其复杂的过程，从种子萌发开始，经历生长发育、开花、传粉受精、结果、衰老和死亡。植物在生长发育过程中会遭受到一系列外界环境胁迫，为了应对生长发育过程中遇到的不利环境条件，植物进化出了复杂的调控网络以降低外界胁迫对自身的伤害。细胞分裂素作为一种重要的植物激素，在这个调控网络中发挥重要作用。 细胞分裂素是一类腺嘌呤衍生物，能够参与细胞的分裂与分化，诱导芽形成以及促进芽生长，参与种子萌发以及花和果实发育等。细胞分裂素氧化/脱氢酶（CKXs）能够催化CTKs的不可逆降解，从而参与植物的一系列生长发育过程，它是目前唯一已知的特异性降解CTKs的酶。研究表明，大多数CKXs基因表达受干旱胁迫诱导，过量表达CKX能增加对非生物胁迫的耐受性，且CKXs还能够影响植物发育过程。而在苹果中，对CKXs的研究还较少。 本文中，首先从苹果基因组数据库中找到10个MdCKXs基因，并进行进化树分析及生物信息学分析，然后通过实时荧光定量PCR对这些苹果CKX家族成员进行非生物胁迫响应分析，发现MdCKX7.2（基因序列号：MDP0000279125）对于ABA的响应明显高于其他成员，因此选择该基因作为主要研究对象。从‘嘎拉’苹果（Malus×domestica Borkh.）基因组中克隆到MdCKX7.2基因，对该基因启动子进行分析，发现MdCKX7.2启动子序列中存在多种与胁迫响应相关的作用元件，表明其可能参与植物对不良环境的响应。为了研究该基因的生物学功能，得到了MdCKX7.2转基因拟南芥，并对转基因拟南芥进行了干旱、ABA和低磷响应的检测。试验结果如下： 1.MdCKX7.2基因的生物信息学分析 MdCKX7.2基因大小为1542bp，编码513个氨基酸。基因结构分析表明，MdCKX7.2含有5个外显子，4个内含子，定位在苹果第8号染色体上。蛋白保守结构域分析表明，MdCKX7.2在N末端具有保守的FAD结合结构域，在C末端具有保守的细胞分裂素结合结构域。 2.异位表达MdCKX7.2基因提高拟南芥对干旱胁迫的抗性 在MdCKX7.2的启动子序列中含有与干旱响应相关的MBS作用元件。表达分析发现，MdCKX7.2的表达明显受到PEG的诱导。对野生型和MdCKX7.2转基因拟南芥进行干旱处理，结果发现，与野生型拟南芥相比，MdCKX7.2转基因植株存活率明显提高。干旱处理后，转基因拟南芥中胁迫应答相关基因RD22、RD29B的表达水平明显高于野生型。以上结果表明，异位表达MdCKX7.2基因，增强了植株对干旱的抗性。 3.MdCKX7.2参与ABA介导的种子萌发调控过程 启动子顺式作用元件分析表明，MdCKX7.2的启动子中含有与ABA响应相关的ABRE元件。实时荧光定量PCR分析发现，MdCKX7.2的表达明显受ABA的诱导。用1μmol·L-1ABA处理MdCKX7.2转基因拟南芥及野生型种子，发现与野生型相比，MdCKX7.2转基因拟南芥种子萌发率及鲜重显著降低，与种子萌发相关的ABI5、EM1、EM6及RD29B的表达水平明显上调。说明在拟南芥中异位表达MdCKX7.2基因提高了植株其对ABA的敏感性。 4.MdCKX7.2参与植物对磷元素的吸收和利用 实时荧光定量PCR分析发现，MdCKX7.2的表达明显受低磷胁迫的诱导。用低磷（40μmol·L-1）培养基处理野生型及MdCKX7.2转基因拟南芥，结果发现，与野生型对照相比，MdCKX7.2转基因拟南芥幼苗的主根长度明显较长，鲜重增加，脯氨酸含量升高。以上结果说明，在拟南芥中异位表达MdCKX7.2基因，提高了其对低磷的耐受性。

目录

声明

符号说明

1 前言

1.1 细胞分裂素(CTKs）与细胞分裂素氧化/脱氢酶编码基因CKXs

1.1.1 细胞分裂素的合成及其在植物生长发育过程中的作用

1.1.2细胞分裂素氧化/脱氢酶（CKXs）的作用及研究现状

1.2 干旱胁迫对植物生长发育的影响

1.2.1 我国水资源现状

1.2.2 干旱对植物生长发育的影响及研究现状

1.3 ABA在植物中的生理功能

1.3.1 ABA调控植物生长发育

1.3.2 ABA调控植物应对外界逆境胁迫

1.4 磷元素对植物生长发育的影响

1.5 本研究的目的和意义

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 载体

2.1.6 PCR引物及测序

2.1.7 其他试剂和药品

2.1.8抗生素

2.1.9培养基

2.1.10 实验仪器

2.2 实验方法

2.2.1 植物组织总RNA提取

2.2.2 去除植物基因组DNA

2.2.3反转录cDNA第一链的合成

2.2.4 cDNA模板的合成

2.2.5 基因扩增

2.2.6 总RNA含量与纯度检测

2.2.7 回收纯化DNA

2.2.8 连接克隆载体

2.2.10 质粒的提取

2.2.11 测序

2.2.12 双酶切反应

2.2.13 表达载体的构建

2.2.14 农杆菌转化

2.2.15 植物基因组DNA的提取

2.2.16拟南芥的种植及遗传转化

2.2.17相关处理及生理指标的测定

2.2.18生物信息学分析方法

3 结果与分析

3.1 苹果CKX基因家族成员的生物信息学分析及非生物胁迫响应分析

3.1.1 苹果CKX基因家族成员的进化树分析

3.1.2 苹果CKX家族成员的染色体定位及基因结构分析

3.1.3 苹果CKX家族成员基因对非生物胁迫的响应分析

3.2 MdCKX7.2基因的分子克隆与序列分析

3.2.1 MdCKX7.2基因的分子克隆

3.2.2 MdCKX7.2与拟南芥CKX家族同源比对与保守域分析

3.3 MdCKX7.2启动子顺式作用元件分析

3.4 MdCKX7.2基因对PEG的表达响应

3.5 MdCKX7.2转基因拟南芥的获得及对生长发育的影响

3.5.1 MdCKX7.2转基因拟南芥的筛选与鉴定

3.5.2 MdCKX7.2促进转基因拟南芥侧根发育

3.5.3 MdCKX7.2促进转基因拟南芥早花

3.6 异位表达MdCKX7.2提高拟南芥对干旱胁迫的抗性

3.7 MdCKX7.2参与ABA介导的种子萌发调控过程

3.8 MdCKX7.2参与植物磷营养元素的吸收和利用

3.8.1 苹果MdCKX7.2基因的低磷响应

3.8.2 异位表达MdCKX7.2增强拟南芥对低磷胁迫的耐受性

3.8.3 异位表达MdCKX7.2提高拟南芥对磷营养元素的吸收利用能力

4 讨论

4.1 MdCKX7.2在植物干旱胁迫耐受性方面的作用

4.2 MdCKX7.2转基因植株对ABA的敏感性增强

4.3 MdCKX7.2调控磷元素的吸收利用

5 结论

参考文献

7 附录

致谢

9 攻读学位期间发表论文情况