内质网应激和组蛋白甲基化在高同型半胱氨酸血症促斑块不稳定中作用和机制研究

摘要

目的：
　　动脉粥样硬化是起源于脂代谢失衡和炎症过度激活的慢性血管壁疾病。数十年来，动脉粥样硬化相关疾病已成为全球致残、致死的首要原因。在我国，随着人民生活水平提高和饮食习惯的改变，动脉粥样硬化及其相关疾病的发病率也呈现逐年升高的趋势，成为主要的死亡原因。临床研究表明引起急性心血管事件的主要原因是冠状动脉晚期粥样硬化斑块的突然破裂以及由此引发的血栓形成，而动脉粥样硬化斑块的不稳定是导致斑块破裂的重要原因。因此，研究影响斑块易损性的因素和机制，探索相应的干预方法，对冠心病的防治具有重要的价值。数百项临床观察性研究提示同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）与动脉粥样硬化密切相关。尤为重要的是，临床中已证实高同型半胱氨酸血症是颈动脉和冠状动脉易损斑块形成的独立危险因素。在动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠模型发现存在高同型半胱氨酸血症促进斑块不稳定。观察发现病变区富含巨噬细胞凋亡和增大的坏死核心形成是斑块进展的重要组织学特征。巨噬细胞凋亡贯穿动脉粥样硬化形成始终。与早期动脉粥样硬化形成不同，多个研究证实病变区巨噬细胞凋亡与不稳定斑块形成密切相关。但是高同型半胱氨酸血症如何调控巨噬细胞凋亡和不稳定斑块形成机制不清。慢性持续的内质网应激激活未折叠蛋白反应促进巨噬细胞凋亡。但高同型半胱氨酸血症是否通过激活内质网应激促进巨噬细胞凋亡和不稳定斑块形成，目前未见报道；另一方面，动脉粥样硬化发病机制极其复杂，是环境和遗传因素长期共同作用的结果。最强的遗传因素也仅能解释大约10%的心血管发病机制。同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）是体内转甲基反应的重要中间代谢产物，通过向DNA或蛋白质转运甲基调控基因表达。体内和体外实验已证实Hcy对基因组和候选基因甲基化的调控作用。所以，通过表观调控探索Hcy促动脉粥样硬化发病机制至关重要。近期，越来越多的证据显示组蛋白甲基化在斑块不稳定中发挥重要作用。但是，组蛋白调控在Hcy促进不稳定斑块中的作用目前仍不清楚。
　　所以，本研究中拟通过体内和体外实验，探讨：
　　①巨噬细胞凋亡在Hcy促进不稳定斑块形成中的作用。
　　②内质网应激在Hcy促进巨噬细胞凋亡和不稳定斑块形成中的机制。
　　③组蛋白甲基化在Hcy促进巨噬细胞凋亡和不稳定斑块形成中的作用。为临床预防和干预动脉粥样硬化不稳定斑块形成提供新的靶点。
　　方法：
　　第一部分：
　　8周龄雄性C57BL/6J小鼠和ApoE-/-小鼠各36只，随机分为对照组（12只），高蛋氨酸饲养组（12只）和叶酸干预组（12只），对照组饲以普通AIN-93G饲料，高蛋氨酸饲养组饲以含1.7%蛋氨酸的AIN-93G饲料，叶酸干预组饲以含1.7%的蛋氨酸加0.0008%叶酸AIN-93G饲料，连续饲喂养20周。干预期满后，眼球取血，处死小鼠，全自动生化仪检测血清Hcy和血脂水平。主动脉大体染色和主动脉窦染色评估斑块面积和坏死核心面积，多种特殊染色评估斑块稳定性。TUNEL染色评估斑块区凋亡细胞。培养Raw264.7巨噬细胞，在ox-LDL基础上给予Hcy干预，AVPI和TUNEL技术评估巨噬细胞凋亡，油红O染色观察巨噬细胞脂质沉积，Western Blot检测线粒体凋亡通路凋亡基因的表达；
　　第二部分：
　　8周龄雄性ApoE-/-小鼠36只，分为对照组（12只），高蛋氨酸饲养组（12只）和4-PBA干预组（12只），对照组饲以普通AIN-93G饲料，高蛋氨酸饲养组饲以含1.7%蛋氨酸的AIN-93G饲料，4-PBA干预组饲以含1.7%蛋氨酸的AIN-93G饲料12周后，腹腔注射4-PBA8周。三组小鼠总共干预20周后，眼球取血，处死小鼠，全自动生化仪检测血清Hcy和血脂水平。主动脉大体染色和主动脉窦染色评估斑块面积和坏死核心面积，多种特殊染色评估斑块稳定性。TUNEL染色评估斑块凋亡细胞。培养Raw264.7巨噬细胞，在ox-LDL基础上给予Hcy和4-PBA干预，AVPI和TUNEL技术评估巨噬细胞凋亡，油红O染色观察巨噬细胞脂质沉积，Western Blot检测内质网应激因子和线粒体凋亡通路凋亡基因的表达；
　　第三部分：
　　使用第一部分实验的ApoE-/-小鼠主动脉标本，免疫组化和Western Blot检测主动脉H3K4m2和H3K9m2的表达。培养Raw264.7巨噬细胞，在ox-LDL基础上给予Hcy、组蛋白抑制剂BIX01294和叶酸干预，AVPI和TUNEL检测巨噬细胞凋亡，油红O染色观察巨噬细胞脂质沉积，Western Blot检测组蛋白甲基转移酶G9a和SUV39H1的表达和线粒体凋亡途径基因的表达。
　　结果我们观察到：
　　第一部分
　　（1）20周高蛋氨酸饮食成功诱导了Hhcy，但对血脂无明显影响；
　　（2）单纯高蛋氨酸饮食不能诱发C57BL/6J小鼠发生动脉粥样硬化斑块；
　　（3）高蛋氨酸饮食诱导的Hhcy ApoE-/-小鼠主动脉斑块面积和坏死核心面积增大；
　　（4）高蛋氨酸饮食诱导的Hhcy促进ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块不稳定；
　　（5）高蛋氨酸饮食诱导的Hhcy促进ApoE-/-小鼠斑块区细胞凋亡；
　　（6）Hcy促进Raw264.7巨噬细胞脂质沉积和泡沫化；
　　（7）Hcy促进Raw264.7巨噬细胞发生凋亡；
　　（8）Hcy促进Raw264.7巨噬细胞Cleaved caspase3，Bax表达，抑制Bcl-2表达；
　　第二部分：
　　（9）4-PBA改善Hhcy诱导的ApoE-/-小鼠主动脉斑块进展和坏死核心增大，抑制斑块不稳定；
　　（10）4-PBA减缓高蛋氨酸饮食诱导的 ApoE-/-小鼠主动脉斑块细胞凋亡；
　　（11）4-PBA抑制 Hcy诱导的Raw264.7巨噬细胞脂质沉积和凋亡；
　　（12）高蛋氨酸饮食诱导的Hhcy促进小鼠主动脉组织ERS因子表达升高。4-PBA具有拮抗作用；
　　（13）Hcy促进Raw264.7巨噬细胞ERS因子表达升高。4-PBA具有拮抗作用；
　　（14）4-PBA能够改善Hcy诱导的巨噬细胞Bcl-2途径凋亡因子变化；
　　（15）高蛋氨酸饮食诱导的Hhcy抑制ApoE-/-小鼠主动脉斑块H3K9m2表达，但对H3K4m2表达无明显影响；
　　（16）Hcy调控Raw264.7巨噬细胞组蛋白H3K9m2和组蛋白甲基转移酶G9a表达；
　　（17）组蛋白H3K9m2参与调控Hcy诱导的体外巨噬细胞泡沫化；
　　（18）组蛋白H3K9m2调控Hcy诱导的Raw264.7巨噬细胞凋亡；
　　（19）组蛋白H3K9m2调控线粒体凋亡通路基因的表达。
　　结论：
　　一、Hhcy通过巨噬细胞凋亡促进不稳定斑块形成；
　　二、内质网应激在Hcy促进巨噬细胞凋亡和不稳定斑块形成中发挥重要作用；
　　三、组蛋白H3K9m2参与Hcy介导的巨噬细胞凋亡和斑块不稳定。

目录

声明

英文缩略词表

前言

一．动脉粥样硬化相关疾病是我国目前面临的巨大卫生问题

二．易损斑块形成是多种急性心脑血管疾病发病的根源

三．高同型半胱氨酸血症是AS的独立危险因素

四．高同型半胱氨酸血症促进易损斑块形成机制不清

五．巨噬细胞凋亡在易损斑块形成中起关键作用。

六．内质网应激是巨噬细胞凋亡促进易损斑块形成的重要机制

七．表观调控是探索不稳定斑块形成机制的新途径

第一部分 巨噬细胞凋亡在Hcy促进不稳定斑块形成中的作用机制研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

第二部分 内质网应激在Hcy促进小鼠动脉粥样硬化不稳定斑块形成中的机制

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

第三部分：组蛋白甲基化在Hcy促进巨噬细胞凋亡和不稳定斑块形成中的作用

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

文献综述:同型半胱氨酸促动脉粥样硬化发生的临床研究和机制研究进展

致谢

攻读学位期间发表的学术成果

个人简历