苯基-琼脂糖疏水层析介质的制备及其对果糖基转移酶的分离纯化

摘要

疏水层析是目前生物大分子分离纯化中广泛应用的操作技术。其分离过程具有操作简便、设备简单、条件温和等优点。疏水层析介质是该技术的核心要素，制约着疏水层析效果的优劣。国内主要使用进口疏水层析介质，价格较高。因此制备低成本，高效率的疏水层析介质也日益被提上日程。本论文以琼脂糖凝胶Sepharose CL-6B作为基质，对苯基-琼脂糖（Phenyl-Sepharose CL-6B）疏水层析介质的活化偶联以及直接偶联制备工艺进行研究。
　　在活化偶联法制备Phenyl-Sepharose CL-6B疏水层析介质的实验中，所得最佳活化条件为：二甲基亚砜（DMSO）28 mL/g，环氧氯丙烷（ECH）14.4 mL/g，反应温度35℃，反应时间2.0 h。环氧基密度最高可达0.881μmol/mg干胶。对活化所得琼脂糖凝胶进行配基偶联工艺探索，所得偶联反应的最佳条件为：NaOH19.84 mmol/g，苯酚4mL/g，反应温度50℃，水浴反应时间为4 h。配基密度最高可达0.707μmol/mg干胶，配基偶联率为80.24％。在直接偶联法制备 Phenyl-Sepharose CL-6B疏水层析介质的实验中，最佳反应条件为：苯基缩水甘油醚0.5 mmol/g，三氟化硼乙醚220μL/g，温度30℃，反应时间50 min。所得配基密度可达1.059μmol/mg干胶。
　　为考察自制疏水层析介质Phenyl-Sepharose CL-6B的化学稳定性，分别将两种途径制备所得的介质置于蒸馏水、80%乙醇、2 mol/L氯化钠、6 mol/L尿素和2 mol/L硫酸铵溶液中，经过30天后，介质的配基密度虽有下降，但降幅较小，与之前的配基密度基本无异。保存在乙醇、NaCl、尿素和硫酸铵溶液中的介质与保存在水中的介质吸附等温线无明显差异，说明自制疏水层析介质 Phenyl-Sepharose CL-6B的化学稳定性良好。介质的红外光谱图显示，反应后的介质在1598 cm-1、1495 cm-1以及1497 cm-1处出现苯环的特征吸收峰，表明Sepharose CL-6B介质已偶联上苯基。
　　用自制的疏水层析介质Phenyl-Sepharose CL-6B对果糖基转移酶粗酶液进行分离纯化，以表征该介质的分离性能。首先对发酵所得的解脂耶罗维亚酵母菌上清液（即粗酶液，活力为2.94 IU/mL，比活力为0.16 IU/μg）进行硫酸铵盐析，在65%的硫酸铵饱和度下盐析所得酶活力为76.94 IU/mL，比活力为0.19 IU/μg，活力回收率达95.67%。随后用自制的疏水层析介质对盐析所得酶液进行分离，考察了不同 pH，硫酸铵浓度，径高比，上样量和流速下，两种介质对果糖基转移酶的分离效果，确定了用自制疏水层析介质纯化果糖基转移酶的最适条件。结果表明，在 pH6.5，硫酸铵浓度2.3mol/L，高径比12，上样量0.5 mL，流速1 mL/min的情况下，两种介质均可达到较好的分离效果。最后，用上述条件对果糖基转移酶进行了分离纯化，洗脱峰的活力为6.45 IU/mL，比活力为1.09 IU/μg，其活力回收率可达75%以上，纯化倍数达5倍以上。
　　对疏水层析纯化所得的蛋白质溶液进行 SDS-PAGE，根据条带位置计算 Rf值，并计算得到发酵所得的果糖基转移酶的分子量为72.6 KDa。与发酵上清液相比，条带清晰，表明通过盐析和疏水层析，果糖基转移酶得到了一定程度的纯化。

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1 绪论

1.1 前言

1.2 生物产品分离的一般流程

1.3 层析

1.4 疏水层析介质

1.5 果糖基转移酶

1.6 本研究的目的、内容及意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 分析方法

3 苯基-琼脂糖疏水层析介质的制备

3.1 苯基-琼脂糖疏水层析介质活化单因素实验

3.2 苯基-琼脂糖疏水层析介质活化正交实验

3.3 苯基-琼脂糖疏水层析介质偶联单因素实验

3.4 苯基-琼脂糖疏水层析介质偶联正交实验

3.5 直接偶联法制备苯基-琼脂糖疏水层析介质的单因素实验

3.6 直接偶联法制备苯基-琼脂糖疏水层析介质的正交试验

3.7 本章小结

4 介质的性能研究

4.1 介质化学稳定性

4.2 介质的吸附性能

4.3 介质的红外性能

4.4 本章小结

5 果糖基转移酶的分离纯化

5.1 盐析结果

5.2 疏水层析最优条件的确定

5.3 疏水层析分离纯化果糖基转移酶

5.4 SDS-PAGE测定分子量

5.5 本章小结

6 结论

6.1 主要结论

6.2问题与展望

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的论文