microRNA-34a经HDAC1调节H3K9乙酰化促进同型半胱氨酸致动脉粥样硬化的机制研究

摘要

目的探讨组蛋白H3K9乙酰化在同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）引起动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）中的作用及机制，明确组蛋白去乙酰化酶1（histone deacetylase 1，HDAC1）是调控H3K9乙酰化的重要酶，确定HDAC1对THP-1单核源性泡沫细胞脂质聚集的影响；阐明miR-34a对HDAC1的调控机制，旨在揭示miR-34a经HDAC1调节H3K9乙酰化促进Hcy引起AS的机制。 方法 动物模型的复制：选用6周龄的ApoE-/-小鼠随机分为三组（各组n=10），即模型对照组（ApoE-/-小鼠给予普通小鼠饲料，A-control），高同型半胱氨酸血症组（ApoE-/-小鼠给予额外添加了1.7%蛋氨酸的普通小鼠饲料，Meth），干预组（ApoE-/-小鼠给予额外添加了1.7%蛋氨酸+叶酸+维生素B12的普通小鼠饲料，Meth+F+V），除此之外，单独设置正常对照组（C57BL/6J小鼠给予普通小鼠饲料，N-control），各组小鼠在SPF级环境中饲养16周后麻醉、处死、取材。小鼠主动脉根部切片行HE、油红O和免疫荧光染色，观察各组小鼠主动脉根部粥样硬化程度和脂质沉积情况，通过全自动生化分析仪检测各组小鼠血清当中的Hcy水平，确定实验动物模型复制成功；体外复制 THP-1 单核源性泡沫细胞模型，采用油红 O 染色予以验证，确认成功后将细胞分为空白对照组（0μmol/L Hcy，control），Hcy处理组（100μmol/L Hcy，Hcy），维生素B12和叶酸干预组（100μmol/L Hcy+30μmol/L Folic acid+30μmol/L Vitamin B12，Hcy+F+V），各组干预48h后采用ELISA检测TC、FC、 TG的含量；油红O染色和免疫荧光进一步检测各组泡沫细胞中脂质沉积和脂质相关蛋白的表达；qRT-PCR和Western blot检测各组小鼠主动脉和泡沫细胞中HDAC1 mRNA、蛋白的表达变化及H3K9乙酰化水平；同时，构建HDAC1过表达/干扰载体并转染细胞，48h后验证其自身mRNA及蛋白的表达，进一步检测TC、FC和TG含量的变化；油红O染色和免疫荧光检测HDAC1过表达/干扰泡沫细胞中脂质沉积情况和脂质相关蛋白的表达，Western blot 检测 H3K9 乙酰化的改变；qRT-PCR检测miR-34a的表达，构建miR-34a的过表达/干扰载体并转染THP-1细胞，筛选出miR-34a稳定表达和敲低的细胞系，qRT-PCR验证miR-34a自身的表达和HDAC1 mRNA表达，Western blot测定HDAC1蛋白水平和H3K9乙酰化水平。构建携带HDAC1 3’UTR 野生型（wild type，wt）和突变型（mutant type，mut）的双荧光素酶载体，与miR-34a在泡沫细胞当中共表达，通过双荧光素酶报告基因检测系统测定各组细胞的荧光素酶活性，分析miR-34a是否直接作用于HDAC1 3’UTR区。 结果 1. 小鼠主动脉根部冰冻切片HE和油红O染色结果显示，模型组（高蛋氨酸组）小鼠主动脉出现明显粥样斑块，全自动生化分析仪检测小鼠血清当中Hcy水平，免疫荧光检测斑块中脂质相关蛋白的表达，结果显示，与模型对照组小鼠相比，高蛋氨酸组小鼠的血清Hcy水平明显升高（P<0.05），斑块中脂质相关蛋白ADFP表达明显增多。 2. 采用不同浓度的Hcy分别干预泡沫细胞48h后，测定细胞内TC、FC和TG含量，荧光定量PCR和Western blot检测其HDAC1 mRNA、蛋白的表达以及H3K9乙酰化的水平，油红O染色和免疫荧光进一步检测脂质沉积情况和脂质相关蛋白ADFP的表达，与模型对照组相比，高蛋氨酸组小鼠主动脉及 Hcy 干预后的泡沫细胞当中HDAC1 mRNA及蛋白表达水平显著升高（P<0.05，P<0.05），而H3K9乙酰化的水平明显下降（P<0.05）。 3. 构建HDAC1的过表达/干扰腺病毒载体转入泡沫细胞，进一步采用荧光定量PCR及Western blot验证过表达/干扰HDAC1后细胞的HDAC1自身mRNA、蛋白表达以及H3K9乙酰化水平，ELISA法检测TC、FC和TG的含量，油红O染色和免疫荧光检测进一步验证脂质沉积情况和脂质相关蛋白ADFP的表达，结果显示，与GFP对照组相比，过表达HDAC1后TC、FC和TG含量明显增加，同时，H3K9的乙酰化水平下调（P<0.05，P<0.05，P<0.05，P<0.05），且ADFP也明显增加，而干扰HDAC1之后，可缓解这一结果（P<0.05，P<0.05，P<0.05，P<0.05）。 4. qRT-PCR 检测模型组小鼠主动脉和泡沫细胞中 miR-34a的表达，其表达明显降低（P<0.05，P<0.05）；而在泡沫细胞中过表达miR-34a则可显著下调HDAC1的表达，增加H3K9乙酰化的水平，抑制泡沫细胞脂质沉积（P<0.05，P<0.05），反之，抑制miR-34a可显著增加HDAC1的表达，下调H3K9乙酰化的水平，增加泡沫细胞脂质聚集水平（P<0.05，P<0.05）。分别构建携载有野生型和突变型HDAC1 mRNA 3’UTR序列双荧光素酶载体，与 miR-34a 在泡沫细胞当中共表达，结果显示，转染了野生型HDAC1 mRNA 3’UTR的泡沫细胞中，其荧光素酶活性显著低于转染了突变序列的泡沫细胞（P<0.05）。 结论 1 . Hcy促进HDAC1的表达，降低了H3K9乙酰化水平进而加速泡沫细胞内脂质沉积。 2引起 miR-34a的表达下调，导致 HDAC1 升高、H3K9 乙酰化水平降低，最终加速Hcy致泡沫细胞脂质聚积。. miR-34a能够通过靶向结合HDAC1 3’UTR从而降低HDAC1的表达水平，而Hcy可引起 miR-34a的表达下调，导致 HDAC1 升高、H3K9 乙酰化水平降低，最终加速Hcy致泡沫细胞脂质聚积。

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