调节DNA损伤修复与细胞凋亡的microRNA-34a与云乙酰化酶SIRT1形成负调控环路

摘要

在各种DNA损伤中,双链断裂损伤(DSB)最为严重,它可以引起染色体的重排或缺失,给基因组带来极大危害。针对DSB,细胞主要通过两种保守的通路进行修复,一种是非同源末端连接(NHEJ),另一种是同源重组(HR)。无法修复的DSB或者异常修复的产物往往和很多疾病的发生相关,更为严重的是,DSB修复的异常还会大大增加个体罹患肿瘤的概率,因此DSB修复过程的精细调控在细胞完成正常生理功能的过程中具有重要意义。
　　 DSB修复调节网络的核心部分是与修复相关的蛋白质因子间的相互作用和修饰:包括研究得最为清楚的蛋白质的磷酸化,以及其他的蛋白质修饰如乙酰化、泛素化、甲基化甚至两种或以上的修饰状态的组合共同参与调节DSB修复的活性。而转录水平的调节构成了DSB修复调控的另一个层次,比如HR通路的核心因子Rad51可以被包括p53在内的多个转录因子调节,从而影响到HR的修复活性。最近的研究发现,一个与DSB修复密切相关的基因SIRT1的mRNA受到RNA结合蛋白HuR在转录后水平的调节,这提示可能有更多的DSB修复相关基因受到转录后水平的调节。
　　 microRNA(miRNA)是一类通过结合靶基因mRNA3'-UTR区而实现转录后调控的小RNA分子,近年的研究表明miRNA分子在多种生理过程中发挥作用,并且和很多疾病的发生相关。DSBR相关的基因可能也受到miRNA分子介导的转录后调节。我们使用靶位点预测软件分析可能作用于Rad51、XRCC3等DSB修复基因的miRNA,最终选择了miR-34s作为候选分子。
　　 我们通过生物信息学分析发现miR-34s的另一个可能靶基因是SIRT1。SIRT1是NAD+依赖的Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶,在促进应激状态下细胞存活和维持基因组稳定性中发挥调节作用。过去的研究发现,SIRT1可以去乙酰化多个DSB修复相关的蛋白质因子而影响它们的活性或稳定性,这些修复相关蛋白包括p53、FoxO3a、Ku70、WRN和NBS1,并且SIRT1可以促进DSB修复。此外,最新的研究发现,p53可以反式激活miR-34s的表达并且后者会促进细胞凋亡。通过对上述信息的分析我们推测miR-34s和SIRT1,p53以及其他未知的转录因子可能构成调节环路,在DSB修复和细胞生存的调节中发挥作用。
　　 我们首先构建了miR-34s的表达载体并通过Northern blot的方法验证它们可以正确表达。通过3’-UTR报告基因实验发现,DSB修复相关蛋白Rad51和SIRT1是miR-34s的直接靶基因。进而我们通过DSB修复实验发现miR-34s可以抑制HR修复的活性,而对单链损伤和质粒重连的活性没有影响。在使用依托泊苷处理引起内源基因组DSB的情况下,我们通过彗星实验发现miR-34a抑制总体的DSB修复活性。
　　 严重的DSB或者修复蛋白的功能异常都可能导致细胞凋亡,因而我们也在不同细胞系中检测了miR-34s对凋亡的作用。结果表明,miR-34a可以在Saos-2细胞中明显促进凋亡,但在HeLa和293细胞则没有影响,文献中也报道其他细胞中具有类似现象。这提示miR-34促进凋亡的作用可能通过不同的靶基因完成,而我们发现的靶基因SIRT1可能在某些情况下对此有部分贡献。
　　 我们通过使用SIRT1的抑制剂和通过RNA干扰敲低SIRT1的表达发现SIRT1参与对miR-34a的负调节,并且检测到SIRT1在miR-34a启动子区的结合。已经证实p53可以转录激活miR-34s的表达,而在我们的研究中重复出同样的结果。另外,我们的研究发现,FoxO3a可以在转录水平抑制miR-34a的表达。进一步通过ChIP,我们检测到p53和FoxO3a这两个转录因子结合到miR-34a基因的启动子区。
　　 综上所述,我们发现miR-34a可以通过抑制Rad51和SIRT1表达而抑制DSB修复活性,其自身的表达又受到SIRT1、p53以及FoxO3a的调控。miR-34a与SIRT1、p53以及FoxO3a共同形成调控环路,在调节DSB修复和细胞存活中发挥作用。