嗜肺军团菌rflaA、rmip对小鼠RAW264.7细胞分泌趋化、吞噬、细胞因子功能的影响

摘要

目的：
　　探讨嗜肺军团菌重组鞭毛蛋白（recombinant flagellin A，rflaA）、重组巨噬细胞增强蛋白（recombinant macrophage inflammatory protein，rmip）对小鼠RAW264.7细胞功能影响及其NOD样受体蛋白3（NOD-like receptor protein3，NLRP3）、核苷酸结合寡聚化结构域受体1（Nucleotide-binding Oligomerization Domain1，NOD1）、核苷酸结合寡聚化结构域受体2（Nucleotide-binding Oligomerization Domain1，NOD2）是否参与分泌细胞因子功能初步研究。
　　方法：
　　1.实验分组：采用（0.00、0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000）μg/mL rflaA、（0、0.067、0.136、0.271、0.542、1.084、2.168、4.335）μg/mL rmip处理RAW264.7细胞，并设立细胞对照组，采用CCK-8法确定rflaA、rmip半数效应剂量（median effective concentration，EC50）。按照EC50测定剂量分别稀释1/5、1/10、1/20进行实验分组，（0.04μg/mL rflaA低剂量组、0.08μg/mL rflaA中剂量组、0.16μg/mL rflaA高剂量组） rflaA及（0.02μg/mL rmip低剂量组、0.04μg/mL rmip中剂量组、0.08μg/mL rmip高剂量组）rmip处理 RAW264.7细胞，并设细胞对照组。
　　2.细胞活性测定：将倍比稀释的 rflaA、rmip分别作用RAW264.7细胞24、48、72h，用cck8法检测细胞活性。
　　3.用不同剂量rflaA、rmip处理 RAW264.7细胞作用24h，检测趋化功能；收集细胞上清液，ELISA检测 RAW264.7细胞分泌趋化因子单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein1，MCP-1）、巨噬细胞移动抑制因子（Macrophage Migration Inhibitory Factor，MIF）的分泌水平。
　　4.用不同剂量rflaA、rmip处理RAW264.7细胞作用6、12、24、36、48 h，收集细胞，采用qRT-PCR法检测MCP-1、MIF的 mRNA含量。
　　5.用不同剂量rflaA、rmip处理RAW264.7细胞作用24、48、72h检测细胞吞噬功能。
　　6.分别收集24、36、48h细胞上清液，采用ELISA检测RAW264.7细胞分泌白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白细胞介素-1β（Interleukin-1beta，IL-1β）、白细胞介素-1α（Interleukin-1α，IL-1α）、白细胞介素-10（Interleukin-10，IL-10）。
　　7.用不同剂量rflaA、rmip处理RAW264.7细胞作用6、12、24、36、48 h，收集细胞，采用qRT-PCR法检测IL-6、IL-1β、IL-1α、IL-10、干扰素-r（lnterferon gamma，IFN-r）、肿瘤坏死因子a（tumor necrosis factor，TNF-a）、NLRP3、NOD1、NOD2、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（the receptor-interacting serin-threonine protein kinase2，RIP2）、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶1（cysteinyl aspartate-specific-1，CASP-1）mRNA含量。采用Western blot法检测 NOD1、NOD2、RIP2、NLRP3、CASP-1蛋白表达水平。
　　统计学分析
　　用GraphPad Prism5.0软件计算rflaA、rmip重组蛋白的EC50；计量资料数据采用x±s表示，多组不同时间数据比较方差分析，采用SPSS19.0统计学软件分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果：
　　1.细胞活性检测：结果显示，RAW264.7细胞的活性随着rflaA、rmip剂量的增加而活性降低。有显著差异性（P<0.01），随着rflaA、rmip剂量的增加，RAW264.7细胞的活性降低，有显著差异性（P<0.01），24h优于其它时间段，不同时间存在交互效应（P<0.05）最大值在孵育24h，最小值在孵育72h。用GraphPad Prism5.0软件计算rflaA蛋白的EC50，rfla EC50剂量0.8μg/mL，rmip EC50剂量0.43ug/mL。
　　2.rflaA、rmip促进 RAW264.7细胞的MCP-1、MIF分泌。不同剂量 rflaA、rmip作用 RAW264.7细胞24h后，MCP-1、MIF分泌能力随重组蛋白剂量增加而增加，尤以高剂量时增加明显，与对照组及其它分组均有差异性（P<0.05）。
　　3.rflaA、rmip促进RAW264.7细胞MCP-1、MIF mRNA水平表达，不同剂量rflaA、rmip作用RAW264.7细胞6、12、24、36、48h后，随剂量增加促进 MCP-1、MIF分泌，以高剂量时分泌水平增加明显，12h时分泌水平达到峰值。随着作用时长增加有下降趋势，与对照组及其它分组均有差异性（P<0.05）。
　　4.rflaA、rmip作用RAW264.7细胞，其吞噬功能减弱，不同剂量rflaA、rmip作用RAW264.7细胞24h、48、72h后，随重组蛋白增加吞噬功能下降，与对照组均有差异性（P<0.05）。
　　5.不同剂量的rflaA、rmip作用RAW264.7细胞24、36、48h后，随着重组蛋白剂量的增加分泌增加，RAW264.7分泌细胞因子IL-6、IL-1β、IL-1α、IL-10增加，以高剂量增加明显，36h分泌达峰值，随着作用时长延长有下降趋势，与对照组均有差异性（P<0.05）。
　　6.不同剂量的rflaA、rmip作用RAW264.7细胞6、12、24、36、48h后，随着重组蛋白剂量的增加分泌增加，RAW264.7细胞 IL-6、IL-1β、IL-1α、IL-10、IFN-γ、TNF-α、NOD1、NOD2、RIP2、NLRP3、CASP-1mRNA表达水平增加，以高剂量表达水平增加明显，12h时表达水平达到峰值，随着作用时长增加有下降趋势，与对照组及其它分组均有差异性（P<0.05）。
　　7.不同剂量的rflaA、rmip作用RAW264.7细胞6、12、24、36、48 h后，随剂量增加NOD1、NOD2、RIP2、NLRP3、CASP-1表达水平，以高剂量蛋白表达量增加明显，24h达峰值，随着作用时长表达量有下降趋势，与对照组及其它分组有差异性（P<0.05）。
　　结论：
　　1.rflaA、rmip增加巨噬细胞趋化功能及细胞因子分泌，下调其吞噬能力。
　　2.rflaA可以促进巨噬细胞因子分泌，可能与NLRP3、CASP-1调控有关。
　　3.rmip可以促进巨噬细胞因子分泌。可能与NOD1、NOD2、RIP2调控有关。

目录

声明

中英文缩略词说明

前言

第一部分 rflaA、rmip对小鼠RAW264.7细胞分泌趋化、吞噬功能影响

引言

材料与方法

结果

讨论

第二部分 rflaA、rmip对小鼠RAW264.7细胞作用机制初步探讨

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述:嗜肺军团菌的致病性研究进展

致谢

攻读硕士研究生期间发表的文章

个人简历