地衣芽孢杆菌α-乙酰乳酸脱羧酶基因在酿酒酵母工业菌株中的表达

摘要

在啤酒生产中,双乙酰(diacetyl)是影响啤酒风味的重要物质之一,它的口味阀值很低(0.02-0.10mg/L),当双乙酰的浓度超过口味阀值时会使啤酒产生一种很不愉快的馊酸味,严重影响啤酒的风味和质量.该文通过敏感度实验测定了三株酿酒酵母工业菌株对G418和Cu<'2+>的最大抗性,发现三株菌对G418的耐受性差别很大,SPSC酒精酵母耐受性最强达到750μg/ml,三孔酿酒酵母耐受性最差,只有100μg/ml.同株菌在不同的培养基上对铜离子的耐受性相差也很大,SPSC酒精酵母在YEPD培养基上可以耐受15mmol/L Cu<'2+>,但在CSM培养基上只可以耐受1mmol/L Cu<'2+>.对工业菌株三孔酿酒酵母进行醋酸锂法转化的系列条件做了研究,确定OD<,600>值0.8-1.0时是最佳细胞收获时间,转化子先在完全培养基上生长6h再涂布G418选取平板可以大大提高转化子的数量,初步建立了三孔酿酒酵母的转化体系.

目录

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摘 要

Abstract

本文缩写词表

1.绪论

1.1啤酒发酵中双乙酰的产生

1.1.1啤酒发酵中的双乙酰

1.1.2双乙酰的产生与还原

1.2控制双乙酰的方法

1.2.1优化发酵工艺

1.2.2使用α-乙酰乳酸脱羧酶制剂

1.2.3构建含α-乙酰乳酸脱羧酶基因的酿酒酵母工程菌

1.3本实验室的前期工作及本论文的研究工作

2.材料与方法

2.1菌种与质粒

2.2培养基

2.3微生物学技术

2.3.1菌体的生长

2.3.2菌种的保存

2.4分子生物学方法

2.4.1大肠杆菌中质粒的提取

2.4.2酵母染色体的提取

2.4.3琼脂糖凝胶中DNA片段的回收

2.4.4 DNA纯度和浓度的测定

2.4.5琼脂糖凝胶电泳

2.4.6限制性核酸内切酶酶切

2.4.7酶切片段的去磷酸化、连接

2.4.8大肠杆菌转化

2.4.9酵母茵完整细胞转化

2.4.10 PCR反应

2.5酶学及生物化学方法

2.5.1玻璃珠破碎酵母细胞制备粗酶液

2.5.2蛋白质含量测定

2.5.3 α-乙酰乳酸脱羧酶酶活性的测定

2.6发酵性能的测定

2.6.1表观发酵度的测定

2.6.2酵母凝集力的测定

2.6.3酒精含量的测定

2.6.4双乙酰含量的测定

3.结果和讨论：

3.1 α-乙酰乳酸脱羧酶基因在工业酿酒酵母菌株中的稳定高效表达

3.1.1含有α-ALDC基因整合型载体的G418抗性基因的标记

3.1.2工业菌株的转化条件的探索

3.1.3工业菌株的转化和转化子的筛选验证

3.1.4工程菌营养需求和酶活稳定性的测定

3.2改造后酿酒酵母发酵性能的测定

3.2.1双乙酰含量的测定

3.2.2发酵力和表观发酵度的测定

3.2.3工程菌繁殖力和凝集力的测定

3.2.4工程菌株发酵液酒精含量的测定

3.2.5小结

全文总结

参考文献

致 谢