体外人骨髓间充质干细胞向汗腺细胞表型转化的实验研究

摘要

目的:1.在体外建立热休克汗腺细胞模型和骨髓间充质干细胞(MSCs)与汗腺细胞间接共培养体系；2.研究共培养前后MSCs的形态学、细胞表型和基因型的变化情况,探讨MSCs向汗腺细胞分化的可行性。
　　 方法:1.MSCs与汗腺细胞的分离、培养及鉴定①体外分离、培养人成体MSCs和汗腺细胞；②应用倒置相差显微镜观察细胞形态；③应用组织化学染色检测MSCs和汗腺细胞表面标志的表达。2.MSCs与汗腺细胞间接共培养及鉴定①建立汗腺细胞体外休克模型,继续孵育3-5天,收集上清液作为条件培养基对MSCs分化诱导；②对比共培养5天和10天MSCs形态学变化；③对比共培养10天后应用免疫组织化学和流式细胞仪法检测MSCs细胞表型改变；④芯片技术检测共培养后MSCs基因型的变化。
　　 结果:1.体外MSCs与汗腺细胞的分离、培养及鉴定结果:①体外成功培养、扩增MSCs和汗腺细胞；②倒置相差显微镜观察到细胞生长情况良好；③检测MSCs表面标志CD29、CD44、CD105阳性,汗腺细胞表面标志CK7、CK8、CK18、CK19、CEA阳性；2.MSCs与汗腺细胞间接共培养及鉴定结果:①汗腺细胞经热休克后,大多数细胞间连接消失,部分汗腺细胞坏死脱落；②MSCs在应用热休克汗腺后上清液诱导后(即为间接共培养)细胞形态的改变:MSCs诱导前体积较大,呈纤维状分散性分布；诱导5天后细胞体积变小,呈多边形且比较扁平,部分细胞可相互连接成片；诱导10天后细胞进一步连接成片,如“铺路石”样生长形态类似汗腺上皮细胞；③MSCs诱导分化后细胞表型的改变:被诱导的细胞中CEA、CK7、CK8和CK19染色阳性。而对照组没有检测到CEA、CK7、CK8和CK19染色阳性的细胞。流式细胞仪检测CEA、CK7、CK8和CK19的阳性率分别是60.67％、53.34％、54.11％和58.62％；④基因芯片结果分析示:MSCs转分化诱导前后差异表达基因有2567个,其中上调基因有1409个,下调基因958个。功能分类分析(Go-Analysis)结果显示上调基因主要为调控组织形态发生以及外胚层发育和分化的基因,下调基因主要为调控胚胎发育和细胞增殖的基因。
　　 结论:1.成功诱导MSCs,并获得汗腺细胞表型；2.通过建立适当的体外汗腺诱导培养体系,中胚层的MSCs可以通过跨胚层分化途径转变为汗腺样细胞。