利用生物工程技术创造甜菜耐盐新种质

摘要

甜菜(Beta vulgaris L.)是重要的糖料和饲料作物,糖用甜菜提供了全球40％以上的食糖,饲料甜菜是家畜最佳的多汁饲料,块根肥大,营养丰富.甜菜具有耐盐潜质,能在盐分低于0.4％的土壤中正常生长.甜菜的一些近缘野生种起源于滨海,耐盐性较强.饲用甜菜虽生物量大,耐盐性却不高.因此,高耐盐性饲用甜菜的开发和利用,不仅可充分开发利用滨海盐碱地,推动养殖业发展,而且能有效改善生态环境.采用常规育种技术培育甜菜耐盐品种周期长,见效慢,至今还没有培育出适合滨海盐碱地种植的品种.采用生物工程技术可以获得耐盐性大幅度提高的工程植株,并能缩短育种年限,这为甜菜耐盐育种开辟了新途径.通过耐盐细胞突变体筛选等技术,可创造出甜菜耐盐新种质.采用转基因技术,可将从细菌和盐生植物中克隆的耐盐基因导入甜菜,获得高度耐盐的优良甜菜新种质.该论文的目标就是综合利用细胞工程和基因工程技术,培育适合在中国中低度滨海盐碱地中种植的耐盐饲用甜菜新品系.以14个甜菜品种的幼胚、叶柄和沙培小苗下胚轴切段为材料,分别诱导愈伤组织并继代培养.研究了影响愈伤组织诱导频率的因素,对愈伤组织继代培养及分化的条件也进行了探索.在细胞工程技术获得的耐盐种质中,耐盐性最高的品系可耐受2.0％NaCl溶液浇灌,可在含盐量0.9％的土地中获得较高的经济产量.来自同一基因型的植株,转betA基因后代和转AtNXH1基因的后代相比,耐盐性提高的程度相近,均出现了可耐受2.5％NaCl溶液浇灌、可在含盐量1.5％的土地中产生经济产量的株系.同辐照诱变及耐盐筛选的后代相比,转基因植株的后代可表现出更强的耐盐性.

目录

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摘要

Abstract

符号说明

第一部分前言

1.1盐碱地开发利用的意义和现状

1.2甜菜生物技术研究的进展

1.2.1甜菜生物学特性和耐盐性

1.2.2甜菜组织与细胞培养

1.2.3甜菜基因工程育种研究

1.3植物耐盐机理及耐盐基因工程

1.3.1植物耐盐基因工程的策略

1.3.2提高细胞甜菜碱含量的基因工程

1.3.3提高细胞离子区隔化的基因工程

1.3.4转反义PLD基因工程

1.4本工作的目的意义

第二部分材料与方法

2.1实验材料

2.1.1植物材料

2.1.2质粒、菌株

2.2培养基

2.2.1植物材料培养基

2.2.2农杆菌培养基

2.3愈伤组织辐照诱变及植株再生

2.3.1愈伤组织的诱导与分化

2.3.2愈伤组织的辐照诱变和筛选

2.4丛生芽辐照诱变和耐盐植株的再生

2.4.1丛生芽诱导与继代培养

2.4.2丛生芽辐照与耐盐植株再生

2.5遗传转化

2.5.1农杆菌培养

2.5.2选择剂浓度的确定

2.5.3丛生芽块的遗传转化

2.6试管苗移栽及管理

2.7转基因植株的分子生物学检测

2.7.1转化植株的PCR检测

2.7.2转化植株的Southern杂交检测

2.7.3转基因植株的Northern杂交检测

2.8甘氨酸甜菜碱含量测定

2.9耐盐性检测

2.9.1转基因芽的耐盐性检测

2.9.2移栽成活植株的耐盐性检测

2.9.3再生植株后代的耐盐性检测

2.10转基因植株后代的遗传稳定性分析

2.11田间试验

2.12数据处理

第三部分结果与分析

3.1利用细胞工程技术培育耐盐甜菜育种材料

3.1.1愈伤组织诱导和植株再生

3.1.2愈伤组织辐射诱变及耐盐植株的再生

3.1.3丛生芽诱导与植株再生

3.1.4丛生芽辐射诱变及耐盐植株的产生

3.2利用基因工程技术创造耐盐甜菜新种质

3.2.1遗传转化体系的建立

3.2.2转betA基因植株的获得及耐盐性分析

3.2.3AtNHXI基因转入甜菜

3.2.4反义PLDγ基因转入甜菜

3.3甜菜再生植株及其后代的生长发育特性

3.3.2再生植株后代的生长和发育

3.4耐盐甜菜种质的选择和利用

3.4.1细胞工程再生植株的后代

3.4.2转基因植株的后代

3.4.3不同途径获得的甜菜耐盐种质的比较

第四部分讨论

4.1甜菜丛生芽高频率发生的可能机制

4.2农杆菌介导的甜菜遗传转化体系的优化

4.3利用细胞工程技术提高甜菜耐盐性的有效性及意义

4.4利用基因工程技术提高甜菜耐盐性的策略

4.5影响转基因甜菜耐盐性的因素

4.6甜菜耐盐性鉴定方法及其应用价值

4.7反义PLDγ基因在甜菜耐盐基因工程中应用的价值

4.8甜菜再生植株的发育阶段

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文和申请的国家发明专利