文昌鱼斑马鱼早期胚胎发育中GABA受体结合蛋白基因的研究

摘要

文昌鱼(Amphioxus)属头索动物(Cephalochordata),代表着从无脊椎动物到脊椎动物进化过程中一个重要的过渡阶段,被认为是现存的与脊椎动物最接近的无脊椎动物,是研究动物进化和动物胚胎发育的典型材料.该文介绍了从?DNA文库得到的一个长度为996 bp的cDNA序列,该序列编码117个氨基酸的与其他物种的GABARAPL2同源性很高的蛋白质,故命名为文昌鱼GABARAPL2.由GABARAPL2演绎的蛋白质与人的GABARAPL2、小鼠GABARAPL2相同性均为75﹪;与果蝇、疟蚊和线虫的相同性分别为64﹪、64﹪和61﹪.利用clustalX1.81对青岛文昌鱼GABARAPL2和其他同源的已知蛋白进行了比较,同时利用TREEPUZZLE5.0分析获得系统进化树.斑马鱼属于硬骨鱼类,是发育生物学的模式动物之一.要了解文昌鱼脑部特异表达的同源基因的功能及其进化,斑马鱼是一个重要的比较研究对象.通过网上比较,发现与文昌鱼GABARAPL2有较高同源性的斑马鱼GABARAP cDNA.利用RT-PCR方法,得到一个分子量约为500bp的片断,连接到载体后作为模板转录DIG标记的RNA探针,进行原位杂交检测.为了进一步了解斑马鱼GABARAP的情况,通过GenomeWalker获得了斑马鱼GABAPRAP基因及其侧翼的DNA序列,通过与cDNA序列比较,发现该基因的编码序列中含有3个内含子,长度分别为678、97、119bp,使编码序列分散在4个外显子中.3个内含子的拼接点处均为↓GT……AG↓序列,符合Breathnach-Chambon规则.斑马鱼GABARAP的起始密码ATG位于第一外显子中,终止密码TAA位于第四外显子中,共编码122个氨基酸,比文昌鱼的GABARAPL2多5个氨基酸.在起始密码子上游相隔144nt有一个同框的终止密码子TGA,与蛋白质的同源性比较结合分析,证明我们对起始密码子ATG的选择是正确的.线粒体是真核细胞内重要的细胞器,能量生成的场所.由于它功能的重要性,其相关基因是高保守性的.研究文昌鱼中其相关基因的同源性,可以为进化的研究提供佐证.利用RT-PCR及cDNA克隆的测序得到文昌鱼NADH脱氢酶亚基I的全长cDNA序列.该cDNA全长942bp,共编码314个氨基酸.从进化树来看十字花科的拟南芥和苔纲地钱两种植物与动物之间的歧化时间较早,其次是毕赤酵母,它们与其它的动物显然分别处于三个大的分支.在动物这一枝上,文昌鱼的三个种:白氏文昌鱼(B.belcheri)、矛形文昌鱼(B.lanceolatum)和佛罗里达文昌鱼(B.floridae)之间具有高同源性,并且文昌鱼该基因的歧化时间处在脊椎动物和棘皮动物海胆(S.purpurat)及昆虫纲的果蝇(Drosophila)之间.

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摘要

ABSTRACT

第一部分文昌鱼发育机制研究进展

第二部分青岛文昌鱼GABARAPL2的克隆及其在早期发育中的表达

材料和方法

结果与讨论

参考文献

第三部分斑马鱼GABARAP的克隆及其在早期发育中的表达

材料和方法

结果与讨论

第四部分青岛文昌鱼差减cDNA文库的构建

材料与方法

结果与讨论

第五部分 青岛文昌鱼NADH脱氢酶亚基Ⅰ的克隆与分析

材料与方法

结果与讨论

参考文献

总结

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致谢

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